Розчин мРНК повної довжини PacBio 2+3
особливості
● Дизайн дослідження:
Об’єднаний зразок, секвенований за допомогою PacBio для ідентифікації ізоформ транскриптів
Окремі зразки (репліки та умови для тестування), секвеновані за допомогоюNGS для кількісного визначення експресії транскрипту
● Секвенування PacBio в режимі CCS, генерація зчитувань HiFi
● Секвенування повноформатних стенограм
● Для аналізу не потрібен еталонний геном; однак його можна використовувати
● Біоінформаційний аналіз включає не лише експресію на рівні гена та ізоформи, але й аналіз lncRNA, злиття генів, поліаденілування та структури гена
Переваги
● Висока точність: HiFi зчитує з точністю >99,9% (Q30), порівнянно з NGS
● Альтернативний аналіз сплайсингу: секвенування всіх транскриптів дозволяє ідентифікувати та охарактеризувати ізоформи.
● Поєднання сильних сторін PacBio та NGS: можливість кількісного визначення експресії на рівні ізоформи, виявлення змін, які можуть бути замасковані під час аналізу всієї експресії гена
● Великий досвід: з досвідом виконання понад 1100 проектів повнорозмірних транскриптомів PacBio та обробки понад 2300 зразків наша команда вносить багатий досвід у кожен проект.
● Післяпродажна підтримка: наше зобов’язання поширюється на період після завершення проекту з 3-місячним періодом післяпродажного обслуговування. Протягом цього часу ми пропонуємо подальше спостереження за проектом, допомогу з усунення несправностей і сеанси запитань і відповідей, щоб відповісти на будь-які запитання, пов’язані з результатами.
Вимоги до зразків і доставка
| Бібліотека | Стратегія секвенування | Рекомендовані дані | Контроль якості |
| Бібліотека CCS, збагачена PolyA мРНК | PacBio Продовження II PacBio Revio | 20/40 Гб 5/10 M CCS | Q30≥85% |
| Полі А збагачений | Illumina PE150 | 6-10 Гб | Q30≥85% |
Нуклеотиди
|
| Конц. (нг/мкл) | Кількість (мкг) | Чистота | Цілісність |
| Бібліотека Illumina | ≥ 10 | ≥ 0,2 | OD260/280=1,7-2,5 OD260/230=0,5-2,5 На гелі виявлено обмежене забруднення білком або ДНК або його відсутність. | Для рослин: RIN≥4,0; Для тварин: RIN≥4,5; 5,0≥28S/18S≥1,0; обмежене підвищення або відсутність базової лінії |
| Бібліотека PacBio | ≥ 100 | ≥ 1,0 | OD260/280=1,7-2,5 OD260/230=0,5-2,5 На гелі виявлено обмежене забруднення білком або ДНК або його відсутність. | Рослини: RIN≥7,5 Тварини: RIN≥8,0 5,0≥28S/18S≥1,0; обмежене підвищення або відсутність базової лінії |
Рекомендована доставка зразків
Контейнер: центрифужна пробірка на 2 мл (фольга не рекомендована)
Зразок маркування: Група + копія, наприклад, A1, A2, A3; B1, B2, B3.
Відвантаження:
1. Сухий лід:Зразки необхідно упакувати в пакети і закопати в сухий лід.
2. Пробірки для стабілізації РНК: зразки РНК можна висушити в пробірці для стабілізації РНК (наприклад, RNAstable®) і відправити при кімнатній температурі.
Включає наступний аналіз:
Контроль якості необроблених даних
Альтернативний аналіз поліаденілування (APA)
Аналіз стенограми Fusion
Альтернативний аналіз сплайсингу
Порівняльний аналіз Universal Single-Copy Orthologis (BUSCO).
Новий аналіз транскриптів: передбачення кодуючих послідовностей (CDS) і функціональна анотація
Аналіз lncRNA: передбачення lncRNA та мішеней
Мікросупутникова ідентифікація (SSR)
Аналіз диференціально експресованих транскриптів (DET).
Аналіз диференціально експресованих генів (DEG).
Функціональна анотація DEG і DET
Аналіз BUSCO
Альтернативний аналіз сплайсингу
Альтернативний аналіз поліаденілування (APA)
Диференційно експресовані гени (DEG) і транскрипти (аналіз DETs9
Білок-білкові мережі взаємодії DET і DEG
Ознайомтеся з досягненнями повнорозмірного секвенування мРНК PacBio 2+3 від BMKGene через підібрану колекцію публікацій.
Chao, Q. та ін. (2019) «Динаміка розвитку транскриптому стебла Populus», Plant Biotechnology Journal, 17(1), стор. 206–219. doi: 10.1111/PBI.12958.
Deng, H. та ін. (2022) «Динамічні зміни вмісту аскорбінової кислоти під час розвитку та дозрівання плодів Actinidia latifolia (багата аскорбатом плодова культура) та пов’язані з цим молекулярні механізми», Міжнародний журнал молекулярних наук, 23(10), стор. 5808. doi: 10.3390/IJMS23105808/S1.
Hua, X. та ін. (2022) «Ефективне передбачення генів біосинтетичного шляху, залучених до біоактивних поліфілінів у Paris polyphylla», Communications Biology 2022 5:1, 5(1), стор. 1–10. doi: 10.1038/s42003-022-03000-z.
Лю, М. та ін. (2023) «Комбінований аналіз PacBio Iso-Seq і Illumina RNA-Seq транскриптому Tuta absoluta (Meyrick) і генів цитохрому P450», Комахи, 14(4), с. 363. doi: 10.3390/INSECTS14040363/S1.
Wang, Lijun та ін. (2019) «Огляд складності транскриптому за допомогою аналізу однієї молекули PacBio у реальному часі в поєднанні з секвенуванням РНК Illumina для кращого розуміння біосинтезу рицинолевої кислоти в Ricinus communis», BMC Genomics, 20(1), стор. 1–17. doi: 10.1186/S12864-019-5832-9/FIGURES/7.
