Цілий геном, що переробляє
Моніторинг геноміки SARS-COV-2 розкриває варіант делеції NSP1, який модулює реакцію інтерферону типу I
Нанопори | Ілюміна | Цілий геном, що перебрався | Метагеноміка | РНК-Seq | Сангер
У цьому дослідженні технології Biomarker надали технічну підтримку зразків секвенування.
Моменти
1. SARS-COV-2 секвенування геному та філігетичний аналіз ідентифікують 35 рецидивуючих мутацій, включаючи 31 SNP та 4 INDELS.
2. Ассоціація з 117 клінічних фенотипів виявляє потенційно
важливі мутації.
∆500-532 в області кодування NSP1 корелює з нижчим вірусним
3. Завантаження та сироватка IFN-β.
4. Вірусні ізоляти з мутацією ∆500-532 індукують менший IFN-I
Відповідь у заражених клітинах.
Експериментальний дизайн
Досягнення
1. Covid-19 епідеміологічний та геномний нагляд
Клінічні дані були зібрані в провінції Сичуань, Китай протягом періоду спалаху з 22 січня 2020 по 20 лютого 2020 р капітал. Підтверджені випадки в Сичуані збільшувались експоненціально, досягнувши максимуму 30 січня. Також дані підтверджували, що соціальне відстань може бути ключовим фактором запобігання поширенню вірусу.
Малюнок 1. Епідеміологічне дослідження Covid-19 в провінції Сичуань, Китай
2. Побудова та варіанти генома SARS-COV-2
При мультиплексній ампліфікації ПЛР з подальшим нанопорним секвенуванням було загалом 310 геномів, що знаходяться в близько 248 пацієнтів. 80% геномів, охоплених 10 читаннями (середня глибина: 0,39 м читається на зразок).
Малюнок 2. Частота кожного варіантів у когорті Сичуань
Всього з геномів SARS-COV-2 були ідентифіковані 104 SNP та 18 інделів, в яких 31 SNP та 4 INDELS були ідентифіковані як рецидивуючі генетичні варіанти. Порівнюючи їх із 169 зразками з Wuhan та з 81,391 високоякісними послідовностями геномів публікації в Gisaid, 29 із 35 варіантів, знайдених на інших континентах. Зокрема, чотири варіанти, включаючи ∆500-532, ACC18108AT, ∆729-737 та T13243C, були знайдені лише у Сичуані та Вухані та відсутні у даних Gisaid, що вказує на те, що ці варіанти дуже ймовірно, що вони не піддаються питанням Вухана, які зустрічаються Подорожні записи пацієнтів.
Еволюційний аналіз з методом максимальної ймовірності (ML) та підходами до молекулярного годинника Байєсівського молекулярного годинника обробляли на 88 нових вірусах Sfrom Sichuan та 250 кураторних геномів з інших регіонів. Геноми з ∆500-532 (делеції в області кодування NSP1) були виявлені розподіленими рідко у філогенетичному дереві. Аналіз гаплотипу на варіантах NSP1 визначив 5 з них з декількох міст. Ці результати свідчать про те, що ∆500-532 відбувався в декількох містах і може бути імпортований кілька разів з Вухана.
Малюнок 2. Рецидивуючі генетичні варіанти та філогенетичний аналіз у геномах SARS-COV-2
3. Асоціація рецидивуючих генетичних варіантів з клінічними наслідками
117 Клінічні фенотипи були пов'язані з тяжкістю Covid-19, де 19 фенотипів, пов’язаних з вираженістю, були класифіковані на важкі та неиверні риси. Зв'язок між цими ознаками та 35 рецидивуючими генетичними варіантами були віруалізовані у теплової карти Bi-кластера. Аналіз збагачення GSEA-подібного рейтингу показав, що ∆500-532 негативно корелює з ESR, сироваткою IFN-β та CD3+ CD8+ T Cell в крові. Більше того, тести qPCR показали, що пацієнти, заражені вірусом, що містять ∆500-532, мали найвищу цінність КТ, тобто найменше вірусне навантаження.
Малюнок 3. Асоціації 35 рецидивуючих генетичних варіантів з клінічними фенотипами
4. Валідація на вірусні мутації, пов’язані з клінічними фенотипами
Для того, щоб зрозуміти вплив ∆500-532 на функції NSP1, клітини HEK239T трансфікували плазмідами, що експресують форми повної довжини, WT NSP1 та мутантні форми з делеціями. Профілі транскриптомів кожної обробленої клітини HEK239T обробляли для аналізу PCA, показуючи, що мутанти делеції кластеризуються відносно ближче і значно відрізнялися від WT NSP1. Гени, які були значно регульовані в мутантах, в основному збагачувались "пептидним біосинтетичним/метаболічним процесом", "біогенезом рибонуклеопротеїну", "націленням на мембрану/ер" тощо. Більше того, два делеції показали чітку схему експресії з WT.
Малюнок 4. Аналіз транскриптомів на клітинах HEK239T, трансфікованих WT NSP1, і з видаленням
Вплив делецій на відповідь IFN-1 також був перевірений у надмірно вираженому дослідженні. Показано, що всі перевірені делеції зменшують IFN-1 Repsonse в трансфікованих клітинах HEK239T та A549 як на рівні транскрипту, так і на рівні білка. Цікаво, що значно регульовані гени в делеціях були збагачені "захисною реакцією на вірус", "реплікацією вірусного геному", "регуляцією транскрипції РНК-полімеразою II" та "Відповідь на інтерферон типу I".
Малюнок 5. Вниз регулювання сигнальних шляхів інтерферону в мутанті ∆500-532
У цьому дослідженні вплив цих делецій на вірус додатково підтверджено дослідженнями вірусної інфекції. Віруси з певними мутантами виділяли з клінічних зразків і заражалися до клітин Calu-3. Детальні результати дослідження вірусної інфекції можна прочитати в статті.
doi:10.1016/j.chom.2021.01.015
Довідник
Lin J, Tang C, Wei H та ін. Геномний моніторинг SARS-COV-2 розкриває варіант делеції NSP1, який модулює інтерферонну відповідь типу I [j]. Host & Microbe, 2021.
Новини та моменти спрямований на обмін останніми успішними випадками з Biomarker Technologies, захоплення нових наукових досягнень, а також видатних методик, застосованих під час дослідження.
Час посади: 06-2022 січня