Tek çekirdekli RNA Sıralaması
Teknik Şema
Çekirdeklerin izolasyonu, çift geçişli sekiz kanallı mikroakışkan sisteminden oluşan 10x Genomics Chromium™ ile sağlanır. Bu sistemde barkodlu ve primerli bir jel boncuk, enzimler ve tek bir çekirdek nanolitre büyüklüğündeki yağ damlası içinde kapsüllenerek Emülsiyon İçinde Jel Boncuk (GEM) üretilir. GEM oluşturulduktan sonra, her GEM'de hücre lizizi ve barkodların serbest bırakılması gerçekleştirilir. mRNA, 10x barkod ve UMI ile cDNA moleküllerine ters kopyalanır ve bunlar ayrıca standart sıralama kütüphanesi yapısına tabidir.
Özellikler
● Dondurulmuş dokulardan tek çekirdek süspansiyonunun hazırlanması
● Emülsiyon İçinde Jel Boncuk (GEM) oluşumu ve ardından cDNA sentezi
● Bir GEM'deki her boncuk 4 bölümden oluşan primerlerle yüklenir:
mRNA hazırlanması ve cDNA sentezi için poli(dT) kuyruğu,
Amplifikasyon yanlılığını düzeltmek için Benzersiz Moleküler Tanımlayıcı (UMI)
10x barkod
Kısmi okuma 1 sıralama primerinin bağlanma dizisi
Avantajları
Tek çekirdekli RNA dizilemesi, tek hücreli RNA dizilemesinin sınırlamalarını aşarak şunları sağlar:
● Dondurulmuş numunelerin kullanımı ve yalnızca taze numunelerle sınırlı olmaması
● Taze hücrelerin enzimatik tedavisiyle karşılaştırıldığında donmuş hücrelerin düşük stresi, transkriptom verilerine daha az stres kaynaklı genler şeklinde yansır
● Kırmızı kan hücrelerinin önceden çıkarılmasına gerek yoktur
● Sınırsız hücre çapı
● Doku ayrışması sırasında hücre kümelenmesine veya tahribatına yatkın olan karmaşık ve hassas doku türleri de dahil olmak üzere, analiz için uygun geniş numune dizisi
Tek hücreli RNA dizilimi ile analiz edilemeyen ve tek çekirdekli RNA dizilimi için uygun olan örnekler:
| Hücre / Doku | Sebep |
| Taze donmuş dokuyu tazeleyin | Yeni veya uzun süredir kaydedilmiş organizasyonlar alınamıyor |
| Kas hücresi, Megakaryosit, Yağ… | Hücre çapı cihaza girilemeyecek kadar büyük |
| Karaciğer… | Kırılamayacak kadar kırılgan, tek hücreleri ayırt edemiyoruz |
| Nöron hücresi, Beyin… | Daha hassas, vurgulanması kolay, sıralama sonuçlarını değiştirecek |
| Pankreas, Tiroid… | Tek hücre süspansiyonunun üretimini etkileyen endojen enzimler açısından zengin |
Tek çekirdekli ve Tek hücreli
| Tek çekirdekli | Tek hücreli |
| Sınırsız hücre çapı | Hücre çapı: 10-40 μm |
| Malzeme donmuş doku olabilir | Malzeme taze doku olmalıdır |
| Dondurulmuş hücrelerin düşük stresi | Enzim tedavisi hücre stres reaksiyonuna neden olabilir |
| Kırmızı kan hücrelerinin çıkarılmasına gerek yoktur | Kırmızı kan hücrelerinin çıkarılması gerekiyor |
| Nükleer biyobilgiyi ifade eder | Tüm hücre biyobilgiyi ifade eder |
Özellikler
| Örnek Gereksinimler | Kütüphane | Sıralama stratejisi | Önerilen veriler | Kalite Kontrol |
| Hayvan dokusu ≥ 200 mg Bitki dokusu ≥ 400 mg | 10x Genomics sn cDNA kütüphanesi | Illumina PE150 | Hücre başına 100.000 PE okuma (100-200 GB) | 700-1200 çekirdek/μl ve mikroskop altında gözlemlenen çekirdek bütünlüğü |
Numune hazırlama kılavuzu ve hizmet iş akışı hakkında daha fazla ayrıntı için lütfen bir uzmanla konuşmaktan çekinmeyin.BMKGENE uzmanı
Hizmet İş Akışı
Aşağıdaki analizi içerir:
● Kalite Kontrol: hücre sayısı, gen tespiti, hücrelerin, RNA moleküllerinin doğru tanımlanması ve ekspresyon miktarının belirlenmesi
● İç Numune Analizi:
Hücre kümeleme ve küme açıklaması
Diferansiyel İfade Analizi: kümelerdeki DEG'lerin tanımlanması
Küme DEG'lerinin işlevsel açıklaması ve zenginleştirilmesi
● Gruplar Arası Analiz:
Verilerin kombinasyonu
Diferansiyel İfade Analizi: DEG'lerin gruplar halinde tanımlanması
Grup DEG'lerinin işlevsel açıklaması ve zenginleştirilmesi
● Gelişmiş Analiz:
Hücre döngüsü analizi
Sahte zaman analizi
Hücre iletişim analizi (CellPhoneDB)
Gen Seti Zenginleştirme Analizi (GSEA)
İç numune analizi
Hücre kümelenmesi:
Diferansiyel İfade Analizi: küme DEG'leri
Gruplar arası analiz
Diferansiyel İfade Analizi: Grup DEG'leri
Gelişmiş Analiz:
Sözde-zaman analizi:
Hücre döngüsü analizi:
BMKGene'nin tek çekirdekli RNA dizileme hizmetlerinin 10X Chromium tarafından kolaylaştırdığı gelişmeleri şu öne çıkan yayınlarda keşfedin:
Wang, L. ve diğerleri. (2021) 'Tek hücreli transkriptomik analiz, steroide dirençli astım alevlenmesinde akciğerin bağışıklık yapısını ortaya koyuyor',Amerika Birleşik Devletleri Ulusal Bilimler Akademisi Bildirileri, 118(2), s. e2005590118. doi: 10.1073/pnas.2005590118
Zheng, H. ve diğerleri. (2022) 'Graves Hastalığı ve Hashimoto Tiroiditinin Mikro Ortamındaki Bağışıklık Hücrelerinde Düzensiz Gen Ekspresyonu ve Anormal Metabolik Sinyalleme için Küresel Düzenleyici Ağ',İmmünolojide Sınırlar, 13, s. 879824. doi: 10.3389/FIMMU.2022.879824/BIBTEX.
Tian, H. ve diğerleri. (2023) 'Tek hücreli transkriptom, pisi balığı (Paralichthys olivaceus)'da etkisizleştirilmiş Edwardsiella tarda ile aşılama sonrasında lökositlerin heterojenliğini ve bağışıklık tepkilerini ortaya çıkarır',Su ürünleri yetiştiriciliği, 566, s. 739238. doi: 10.1016/J.AQUACULTURE.2023.739238.
Yu, Y. ve ark. (2023) 'Fotodinamik terapi, mide kanserli hastalarda anti-tümör bağışıklığını yeniden şekillendirerek bağışıklık kontrol noktası inhibitörlerinin sonucunu iyileştirir',Mide Kanseri, 26(5), s. 798–813. doi: 10.1007/S10120-023-01409-X/METRICS.
