การหาลำดับ RNA นิวเคลียสเดี่ยว
โครงการทางเทคนิค
การแยกนิวเคลียสทำได้โดย 10× Genomics Chromium™ ซึ่งประกอบด้วยระบบไมโครฟลูอิดิกแบบแปดช่องสัญญาณที่มีกากบาทคู่ ในระบบนี้ เม็ดบีดเจลที่มีบาร์โค้ดและไพรเมอร์ เอนไซม์ และนิวเคลียสเดี่ยวถูกห่อหุ้มด้วยหยดน้ำมันขนาดนาโนลิตร ทำให้เกิดเจลบีด-อิน-อิมัลชัน (GEM) เมื่อ GEM ถูกสร้างขึ้นแล้ว จะมีการสลายเซลล์และปล่อยบาร์โค้ดในแต่ละ GEM mRNA จะถูกคัดลอกแบบย้อนกลับไปเป็นโมเลกุล cDNA ด้วยบาร์โค้ด 10× และ UMI ซึ่งขึ้นอยู่กับการสร้างไลบรารีลำดับมาตรฐานเพิ่มเติม
คุณสมบัติ
● การเตรียมสารแขวนลอยนิวเคลียสเดี่ยวจากเนื้อเยื่อแช่แข็ง
● การก่อตัวของเจลบีด-อิน-อิมัลชัน (GEM) ตามด้วยการสังเคราะห์ cDNA
● แต่ละเม็ดใน GEM เต็มไปด้วยไพรเมอร์ที่ประกอบด้วย 4 ส่วน:
ส่วนท้ายโพลี (dT) สำหรับการเตรียม mRNA และการสังเคราะห์ cDNA
ตัวระบุโมเลกุลเฉพาะ (UMI) เพื่อแก้ไขอคติในการขยาย
บาร์โค้ด 10x
ลำดับการเชื่อมโยงของไพรเมอร์ลำดับการอ่านบางส่วน 1
ข้อดี
การจัดลำดับ RNA แบบนิวเคลียสเดี่ยวหลีกเลี่ยงข้อจำกัดของการจัดลำดับ RNA เซลล์เดียว ทำให้:
● การใช้ตัวอย่างแช่แข็งและไม่จำกัดเพียงตัวอย่างสดเท่านั้น
● ความเครียดต่ำของเซลล์ที่ถูกแช่แข็งเมื่อเปรียบเทียบกับการบำบัดด้วยเอนไซม์ของเซลล์ใหม่ ซึ่งสะท้อนให้เห็นในข้อมูลการถอดเสียงในรูปแบบของยีนที่ทำให้เกิดความเครียดน้อยกว่า
● ไม่จำเป็นต้องนำเซลล์เม็ดเลือดแดงออกก่อน
● เส้นผ่านศูนย์กลางเซลล์ไม่จำกัด
● ตัวอย่างจำนวนมากที่มีสิทธิ์ได้รับการวิเคราะห์ รวมถึงประเภทเนื้อเยื่อที่ซับซ้อนและเปราะบางซึ่งมีแนวโน้มที่จะเกิดการจับตัวเป็นก้อนของเซลล์หรือถูกทำลายในระหว่างการแยกตัวของเนื้อเยื่อ
ตัวอย่างที่ไม่สามารถวิเคราะห์โดยการจัดลำดับ RNA เซลล์เดียวและมีสิทธิ์สำหรับการจัดลำดับ RNA นิวเคลียสเดี่ยว:
| เซลล์/เนื้อเยื่อ | เหตุผล |
| เนื้อเยื่อแช่แข็งที่ไม่สด | ไม่สามารถรับองค์กรสดหรือบันทึกมานานได้ |
| เซลล์กล้ามเนื้อ, เมกะคาริโอไซต์, ไขมัน... | เส้นผ่านศูนย์กลางของเซลล์ใหญ่เกินกว่าจะเข้าไปในเครื่องมือได้ |
| ตับ… | เปราะบางเกินกว่าจะแตกหัก ไม่สามารถแยกเซลล์เดี่ยวได้ |
| เซลล์ประสาท สมอง... | ละเอียดอ่อนกว่า เครียดง่าย จะทำให้ผลลัพธ์ของลำดับเปลี่ยนไป |
| ตับอ่อน ไทรอยด์... | อุดมไปด้วยเอนไซม์ภายนอกที่ส่งผลต่อการผลิตสารแขวนลอยเซลล์เดียว |
นิวเคลียสเดี่ยวและเซลล์เดี่ยว
| นิวเคลียสเดี่ยว | เซลล์เดียว |
| เส้นผ่านศูนย์กลางเซลล์ไม่จำกัด | เส้นผ่านศูนย์กลางของเซลล์: 10-40 ไมโครเมตร |
| วัสดุสามารถเป็นเนื้อเยื่อแช่แข็งได้ | วัสดุจะต้องเป็นเนื้อเยื่อสด |
| ความเครียดต่ำของเซลล์แช่แข็ง | การบำบัดด้วยเอนไซม์อาจทำให้เกิดปฏิกิริยาความเครียดของเซลล์ |
| ไม่จำเป็นต้องเอาเซลล์เม็ดเลือดแดงออก | จำเป็นต้องกำจัดเซลล์เม็ดเลือดแดงออก |
| นิวเคลียร์เป็นการแสดงออกถึงข้อมูลทางชีวภาพ | ทั้งเซลล์แสดงข้อมูลทางชีวภาพ |
ข้อมูลจำเพาะ
| ข้อกำหนดตัวอย่าง | ห้องสมุด | กลยุทธ์การจัดลำดับ | ข้อมูลที่แนะนำ | การควบคุมคุณภาพ |
| เนื้อเยื่อสัตว์ ≥ 200 มก เนื้อเยื่อพืช ≥ 400 มก | ไลบรารี Genomics sn cDNA 10 เท่า | อิลลูมิน่า พีอี150 | อ่าน PE 100,000 ต่อเซลล์ (100-200GB) | 700-1200 นิวเคลียส/ไมโครลิตร และความสมบูรณ์ของนิวเคลียสที่สังเกตได้ภายใต้กล้องจุลทรรศน์ |
สำหรับรายละเอียดเพิ่มเติมเกี่ยวกับคำแนะนำในการเตรียมตัวอย่างและขั้นตอนการบริการ โปรดอย่าลังเลที่จะพูดคุยกับ กผู้เชี่ยวชาญของ BMKGENE
ขั้นตอนการทำงานบริการ
รวมถึงการวิเคราะห์ต่อไปนี้:
● การควบคุมคุณภาพ: จำนวนเซลล์ การตรวจหายีน การระบุเซลล์ที่แม่นยำ โมเลกุล RNA และปริมาณการแสดงออก
● การวิเคราะห์ตัวอย่างภายใน:
การจัดกลุ่มเซลล์และคำอธิบายประกอบของคลัสเตอร์
การวิเคราะห์นิพจน์เชิงอนุพันธ์: การระบุ DEG ในกลุ่ม
คำอธิบายประกอบการทำงานและการเพิ่มประสิทธิภาพของ DEG คลัสเตอร์
● การวิเคราะห์ระหว่างกลุ่ม:
การรวมกันของข้อมูล
การวิเคราะห์นิพจน์เชิงอนุพันธ์: การระบุ DEG ในกลุ่ม
คำอธิบายประกอบการทำงานและการเพิ่มคุณค่าของกลุ่ม DEG
● การวิเคราะห์ขั้นสูง:
การวิเคราะห์วัฏจักรของเซลล์
การวิเคราะห์เวลาเทียม
การวิเคราะห์การสื่อสารผ่านเซลล์ (CellPhoneDB)
การวิเคราะห์การเพิ่มปริมาณชุดยีน (GSEA)
การวิเคราะห์ตัวอย่างภายใน
การจัดกลุ่มเซลล์:
การวิเคราะห์นิพจน์เชิงอนุพันธ์: DEG ของคลัสเตอร์
การวิเคราะห์ระหว่างกลุ่ม
การวิเคราะห์นิพจน์เชิงอนุพันธ์: DEG กลุ่ม
การวิเคราะห์ขั้นสูง:
การวิเคราะห์เวลาเทียม:
การวิเคราะห์วัฏจักรของเซลล์:
สำรวจความก้าวหน้าที่อำนวยความสะดวกโดยบริการจัดลำดับ RNA นิวเคลียสเดี่ยวของ BMKGene ด้วย 10X Chromium ในสิ่งพิมพ์เด่นเหล่านี้:
วัง, แอล. และคณะ. (2021) 'การวิเคราะห์ทรานสคริปโตมิกเซลล์เดียวเผยให้เห็นภูมิทัศน์ภูมิคุ้มกันของปอดในการกำเริบของโรคหอบหืดที่ดื้อต่อสเตียรอยด์'การดำเนินการของ National Academy of Sciences แห่งสหรัฐอเมริกา, 118(2), น. อี2005590118. ดอย: 10.1073/pnas.2005590118
เจิ้ง เอช และคณะ (2022) 'เครือข่ายกำกับดูแลระดับโลกสำหรับการแสดงออกของยีนที่ผิดปกติและการส่งสัญญาณการเผาผลาญที่ผิดปกติในเซลล์ภูมิคุ้มกันในสภาพแวดล้อมจุลภาคของโรคเกรฟส์และต่อมไทรอยด์อักเสบของฮาชิโมโตะ'พรมแดนในด้านภูมิคุ้มกันวิทยา, 13, น. 879824. ดอย: 10.3389/FIMMU.2022.879824/BIBTEX.
เทียน เอช และคณะ (2023) 'ทรานสคริปต์เซลล์เดี่ยวเผยให้เห็นความแตกต่างและการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของเม็ดเลือดขาวหลังการฉีดวัคซีนด้วย Edwardsiella tarda ที่ไม่ทำงานในปลาลิ้นหมา (Paralichthys olivaceus)',การเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำ, 566, น. 739238. ดอย: 10.1016/J.AQUACULTURE.2023.739238.
ยู วาย และคณะ (2023) 'การบำบัดด้วยโฟโตไดนามิกช่วยเพิ่มผลลัพธ์ของสารยับยั้งจุดตรวจภูมิคุ้มกันผ่านการเปลี่ยนแปลงภูมิคุ้มกันต่อต้านเนื้องอกในผู้ป่วยมะเร็งกระเพาะอาหาร'มะเร็งกระเพาะอาหาร, 26(5), หน้า 798–813. ดอย: 10.1007/S10120-023-01409-X/METRICS.
