-
การจัดลำดับ RNA นิวเคลียสเดี่ยว
การพัฒนาเทคนิคการจับเซลล์เดี่ยวและการสร้างไลบรารีแบบกำหนดเอง ควบคู่ไปกับการจัดลำดับปริมาณงานสูง ได้ปฏิวัติการศึกษาการแสดงออกของยีนในระดับเซลล์ ความก้าวหน้าครั้งนี้ช่วยให้สามารถวิเคราะห์ประชากรเซลล์ที่ซับซ้อนได้เชิงลึกและครอบคลุมมากขึ้น โดยเอาชนะข้อจำกัดที่เกี่ยวข้องกับการแสดงออกของยีนโดยเฉลี่ยในเซลล์ทั้งหมด และรักษาความหลากหลายที่แท้จริงภายในประชากรเหล่านี้ แม้ว่าการจัดลำดับ RNA เซลล์เดียว (scRNA-seq) มีข้อได้เปรียบที่ไม่อาจปฏิเสธได้ แต่ก็ต้องเผชิญกับความท้าทายในเนื้อเยื่อบางชนิดที่การสร้างสารแขวนลอยเซลล์เดียวพิสูจน์ได้ยากและต้องใช้ตัวอย่างที่สดใหม่ ที่ BMKGene เราจัดการกับอุปสรรคนี้ด้วยการนำเสนอลำดับ RNA แบบนิวเคลียสเดี่ยว (snRNA-seq) โดยใช้เทคโนโลยี 10X Genomics Chromium ที่ล้ำสมัย วิธีการนี้จะขยายสเปกตรัมของตัวอย่างที่สอดคล้องกับการวิเคราะห์การถอดเสียงในระดับเซลล์เดียว
การแยกนิวเคลียสทำได้สำเร็จด้วยชิป 10X Genomics Chromium ที่เป็นนวัตกรรมใหม่ ซึ่งมีระบบไมโครฟลูอิดิกแบบ 8 ช่องทางพร้อมครอสซิ่งแบบคู่ ภายในระบบนี้ เม็ดเจลที่ประกอบด้วยบาร์โค้ด ไพรเมอร์ เอนไซม์ และนิวเคลียสเดี่ยวถูกห่อหุ้มด้วยหยดน้ำมันขนาดนาโนลิตร ทำให้เกิดเป็นเจลบีด-อิน-อิมัลชัน (GEM) หลังจากการก่อตัวของ GEM การสลายเซลล์และการปล่อยบาร์โค้ดจะเกิดขึ้นภายใน GEM แต่ละตัว ต่อจากนั้น โมเลกุล mRNA ได้รับการถอดรหัสแบบย้อนกลับไปเป็น cDNA โดยผสมผสานบาร์โค้ด 10X และตัวระบุโมเลกุลเฉพาะ (UMI) จากนั้น cDNA เหล่านี้จะอยู่ภายใต้การสร้างไลบรารีลำดับมาตรฐาน ซึ่งอำนวยความสะดวกในการสำรวจโปรไฟล์การแสดงออกของยีนในระดับเซลล์เดียวที่มีประสิทธิภาพและครอบคลุม
แพลตฟอร์ม: 10× Genomics Chromium และ Illumina NovaSeq Platform
-
10x การถอดเสียงเชิงพื้นที่ของ Genomics Visium
การถอดเสียงเชิงพื้นที่เป็นเทคโนโลยีล้ำสมัยที่ช่วยให้นักวิจัยสามารถตรวจสอบรูปแบบการแสดงออกของยีนภายในเนื้อเยื่อ ขณะเดียวกันก็รักษาบริบทเชิงพื้นที่ไว้ได้ แพลตฟอร์มอันทรงพลังแห่งหนึ่งในโดเมนนี้คือ 10x Genomics Visium ควบคู่กับการจัดลำดับอิลลูมินา หลักการของ 10X Visium นั้นอยู่บนชิปพิเศษที่มีพื้นที่จับที่กำหนดซึ่งวางส่วนของเนื้อเยื่อไว้ พื้นที่จับภาพนี้มีจุดบาร์โค้ด ซึ่งแต่ละจุดสอดคล้องกับตำแหน่งเชิงพื้นที่เฉพาะภายในเนื้อเยื่อ จากนั้นโมเลกุล RNA ที่ถูกจับจากเนื้อเยื่อจะถูกติดป้ายกำกับด้วยตัวระบุโมเลกุลเฉพาะ (UMI) ในระหว่างกระบวนการถอดรหัสแบบย้อนกลับ จุดบาร์โค้ดและ UMI เหล่านี้ช่วยให้สามารถจัดทำแผนที่เชิงพื้นที่และการหาปริมาณการแสดงออกของยีนได้อย่างแม่นยำด้วยความละเอียดเซลล์เดียว การผสมผสานระหว่างตัวอย่างบาร์โค้ดเชิงพื้นที่และ UMI ช่วยให้มั่นใจในความถูกต้องและความเฉพาะเจาะจงของข้อมูลที่สร้างขึ้น ด้วยการใช้เทคโนโลยี Spatial Transcriptomics นี้ นักวิจัยจะได้รับความเข้าใจที่ลึกซึ้งยิ่งขึ้นเกี่ยวกับการจัดระเบียบเชิงพื้นที่ของเซลล์และปฏิสัมพันธ์ของโมเลกุลที่ซับซ้อนที่เกิดขึ้นภายในเนื้อเยื่อ ซึ่งนำเสนอข้อมูลเชิงลึกอันล้ำค่าเกี่ยวกับกลไกที่เป็นรากฐานของกระบวนการทางชีวภาพในหลากหลายสาขา รวมถึงเนื้องอกวิทยา ประสาทวิทยาศาสตร์ ชีววิทยาพัฒนาการ และภูมิคุ้มกันวิทยา และการศึกษาทางพฤกษศาสตร์
แพลตฟอร์ม: 10X Genomics Visium และ Illumina NovaSeq
-
ลำดับ mRNA ความยาวเต็ม-นาโนพอร์
แม้ว่าการจัดลำดับ mRNA ที่ใช้ NGS เป็นเครื่องมืออเนกประสงค์สำหรับการหาปริมาณการแสดงออกของยีน แต่การพึ่งพาการอ่านแบบสั้นจะจำกัดประสิทธิภาพในการวิเคราะห์การถอดเสียงที่ซับซ้อน ในทางกลับกัน การหาลำดับนาโนพอร์ใช้เทคโนโลยีการอ่านระยะยาว ซึ่งช่วยให้สามารถจัดลำดับทรานสคริปต์ mRNA แบบเต็มความยาวได้ แนวทางนี้อำนวยความสะดวกในการสำรวจที่ครอบคลุมของการต่อรอยทางเลือก การหลอมรวมของยีน โพลีอะดีนิเลชัน และการหาปริมาณของไอโซฟอร์ม mRNA
การหาลำดับนาโนพอร์เป็นวิธีการที่ใช้สัญญาณไฟฟ้าแบบเรียลไทม์โมเลกุลเดี่ยวของนาโนพอร์ ให้ผลลัพธ์แบบเรียลไทม์ DNA แบบเกลียวคู่นำทางโดยโปรตีนจากมอเตอร์จับกับโปรตีนนาโนพอร์ที่ฝังอยู่ในแผ่นชีวะ และคลายตัวเมื่อมันเคลื่อนผ่านช่องนาโนพอร์ภายใต้แรงดันไฟฟ้าที่แตกต่างกัน สัญญาณไฟฟ้าที่โดดเด่นที่สร้างขึ้นจากฐานต่างๆ บนสาย DNA จะถูกตรวจจับและจำแนกตามเวลาจริง ช่วยให้การจัดลำดับนิวคลีโอไทด์แม่นยำและต่อเนื่อง แนวทางที่เป็นนวัตกรรมนี้เอาชนะข้อจำกัดในการอ่านระยะสั้น และมอบแพลตฟอร์มแบบไดนามิกสำหรับการวิเคราะห์จีโนมที่ซับซ้อน รวมถึงการศึกษาเชิงถอดความที่ซับซ้อนพร้อมผลลัพธ์ทันที
แพลตฟอร์ม: Nanopore PromethION 48
-
การหาลำดับ mRNA แบบเต็มความยาว -PacBio
แม้ว่าการจัดลำดับ mRNA ที่ใช้ NGS เป็นเครื่องมืออเนกประสงค์สำหรับการหาปริมาณการแสดงออกของยีน แต่การพึ่งพาการอ่านแบบสั้นจะจำกัดการใช้งานในการวิเคราะห์การถอดเสียงที่ซับซ้อน ในทางกลับกัน การจัดลำดับ PacBio (Iso-Seq) ใช้เทคโนโลยีการอ่านระยะยาว ซึ่งช่วยให้สามารถจัดลำดับการถอดเสียง mRNA แบบเต็มความยาวได้ วิธีการนี้อำนวยความสะดวกในการสำรวจที่ครอบคลุมของการต่อรอยทางเลือก การหลอมรวมของยีน และโพลีอะดีนิเลชั่น อย่างไรก็ตาม มีตัวเลือกอื่นสำหรับการวัดปริมาณการแสดงออกของยีนเนื่องจากมีข้อมูลจำนวนมาก เทคโนโลยีการจัดลำดับ PacBio อาศัยการจัดลำดับโมเลกุลเดี่ยวแบบเรียลไทม์ (SMRT) ซึ่งให้ข้อได้เปรียบที่ชัดเจนในการจับภาพการถอดเสียง mRNA แบบเต็มความยาว แนวทางที่เป็นนวัตกรรมนี้เกี่ยวข้องกับการใช้ท่อนำคลื่นแบบโหมดศูนย์ (ZMW) และหลุมที่ทำจากโครงสร้างขนาดเล็กที่ช่วยให้สามารถสังเกตกิจกรรม DNA polymerase แบบเรียลไทม์ในระหว่างการหาลำดับ ภายใน ZMW เหล่านี้ DNA polymerase ของ PacBio จะสังเคราะห์สาย DNA ที่เสริมกัน ทำให้เกิดการอ่านค่าที่ยาวนานซึ่งครอบคลุมการถอดเสียง mRNA ทั้งหมด การทำงานของ PacBio ในโหมด Circular Consensus Sequencing (CCS) ช่วยเพิ่มความแม่นยำโดยการจัดลำดับโมเลกุลเดียวกันซ้ำๆ การอ่าน HiFi ที่สร้างขึ้นมีความแม่นยำเทียบเท่ากับ NGS ซึ่งช่วยวิเคราะห์คุณสมบัติการถอดรหัสที่ซับซ้อนได้อย่างครอบคลุมและเชื่อถือได้
แพลตฟอร์ม: PacBio ภาคต่อ II; PacBio รีวิโอ
-
ลำดับยูคาริโอต mRNA-NGS
การจัดลำดับ mRNA ซึ่งเป็นเทคโนโลยีอเนกประสงค์ เพิ่มศักยภาพในการสร้างโปรไฟล์ที่ครอบคลุมของการถอดเสียง mRNA ทั้งหมดภายในเซลล์ภายใต้เงื่อนไขเฉพาะ ด้วยการใช้งานที่หลากหลาย เครื่องมือล้ำสมัยนี้เผยให้เห็นโปรไฟล์การแสดงออกของยีนที่ซับซ้อน โครงสร้างยีน และกลไกระดับโมเลกุลที่เกี่ยวข้องกับกระบวนการทางชีววิทยาที่หลากหลาย การจัดลำดับ mRNA ถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายในการวิจัยขั้นพื้นฐาน การวินิจฉัยทางคลินิก และการพัฒนายา โดยให้ข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับความซับซ้อนของพลวัตของเซลล์และการควบคุมทางพันธุกรรม ซึ่งจุดประกายความอยากรู้อยากเห็นเกี่ยวกับศักยภาพของ mRNA ในสาขาต่างๆ
แพลตฟอร์ม: อิลลูมินา NovaSeq X; DNBSEQ-T7
-
ลำดับ mRNA-NGS ที่ไม่อิงการอ้างอิง
การจัดลำดับ mRNA ช่วยให้สามารถสร้างโปรไฟล์ที่ครอบคลุมของการถอดเสียง mRNA ทั้งหมดภายในเซลล์ภายใต้เงื่อนไขเฉพาะ เทคโนโลยีล้ำสมัยนี้ทำหน้าที่เป็นเครื่องมือที่มีศักยภาพในการเปิดเผยโปรไฟล์การแสดงออกของยีนที่ซับซ้อน โครงสร้างยีน และกลไกระดับโมเลกุลที่เกี่ยวข้องกับกระบวนการทางชีววิทยาที่หลากหลาย การจัดลำดับ mRNA ถูกนำมาใช้อย่างกว้างขวางในการวิจัยพื้นฐาน การวินิจฉัยทางคลินิก และการพัฒนายา โดยให้ข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับความซับซ้อนของพลวัตของเซลล์และการควบคุมทางพันธุกรรม
แพลตฟอร์ม: อิลลูมินา NovaSeq X; DNBSEQ-T7
-
ลำดับแบบไม่เข้ารหัสแบบยาว-Illumina
RNA ที่ไม่เข้ารหัสขนาดยาว (lncRNAs) มีความยาวมากกว่า 200 นิวคลีโอไทด์ที่มีศักยภาพในการเข้ารหัสน้อยที่สุดและเป็นองค์ประกอบสำคัญภายใน RNA ที่ไม่ได้เข้ารหัส พบในนิวเคลียสและไซโตพลาสซึม RNA เหล่านี้มีบทบาทสำคัญในการควบคุม epigenetic, transcriptional และ post-transcriptional โดยเน้นย้ำความสำคัญในการสร้างกระบวนการเซลล์และโมเลกุล การจัดลำดับ LncRNA เป็นเครื่องมืออันทรงพลังในการสร้างความแตกต่างของเซลล์ การสร้างเซลล์ และโรคของมนุษย์
แพลตฟอร์ม: อิลลูมินา NovaSeq
-
ลำดับ RNA ขนาดเล็ก - อิลลูมินา
โมเลกุล RNA (sRNA) ขนาดเล็ก ได้แก่ microRNAs (miRNAs), RNAs ที่รบกวนขนาดเล็ก (siRNAs) และ RNA ที่มีปฏิสัมพันธ์กับ Piwi (piRNAs) ในบรรดาสิ่งเหล่านี้ miRNA ซึ่งมีความยาวประมาณ 18-25 นิวคลีโอไทด์ มีความสำคัญเป็นพิเศษสำหรับบทบาทด้านกฎระเบียบที่สำคัญในกระบวนการเซลล์ต่างๆ ด้วยรูปแบบการแสดงออกเฉพาะเนื้อเยื่อและเฉพาะระยะ miRNA จึงมีการอนุรักษ์สูงในสายพันธุ์ต่างๆ
แพลตฟอร์ม: อิลลูมินา NovaSeq
-
ลำดับ CircRNA-อิลลูมินา
การจัดลำดับ RNA แบบวงกลม (circRNA-seq) คือการรวบรวมโปรไฟล์และวิเคราะห์ RNA แบบวงกลม ซึ่งเป็นคลาสของโมเลกุล RNA ที่ก่อตัวเป็นลูปปิดเนื่องจากเหตุการณ์การต่อรอยที่ไม่เป็นที่ยอมรับ ทำให้ RNA นี้มีเสถียรภาพเพิ่มขึ้น แม้ว่า circRNA บางตัวจะทำหน้าที่เป็นฟองน้ำ microRNA โดยแยก microRNA และป้องกันไม่ให้พวกมันควบคุม mRNA เป้าหมาย แต่ circRNA อื่นๆ อาจโต้ตอบกับโปรตีน ปรับการแสดงออกของยีน หรือมีบทบาทในกระบวนการเซลล์ การวิเคราะห์การแสดงออกของ circRNA ให้ข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับบทบาทด้านกฎระเบียบของโมเลกุลเหล่านี้ และความสำคัญของโมเลกุลเหล่านี้ในกระบวนการเซลล์ ระยะการพัฒนา และสภาวะของโรคต่างๆ ซึ่งมีส่วนช่วยให้เข้าใจอย่างลึกซึ้งยิ่งขึ้นเกี่ยวกับความซับซ้อนของการควบคุม RNA ในบริบทของการแสดงออกของยีน
-
ลำดับการถอดเสียงทั้งหมด - อิลลูมินา
การจัดลำดับทรานสคริปต์ทั้งหมดนำเสนอวิธีการที่ครอบคลุมในการสร้างโปรไฟล์โมเลกุล RNA ที่หลากหลาย ครอบคลุมการเข้ารหัส (mRNA) และ RNA ที่ไม่เข้ารหัส (lncRNA, circRNA และ miRNA) เทคนิคนี้จะรวบรวมทรานสคริปโตมทั้งหมดของเซลล์เฉพาะในช่วงเวลาที่กำหนด ช่วยให้เข้าใจกระบวนการของเซลล์แบบองค์รวม มีชื่อเรียกอีกอย่างว่า "การจัดลำดับ RNA ทั้งหมด" โดยมีจุดมุ่งหมายเพื่อเปิดเผยเครือข่ายการกำกับดูแลที่ซับซ้อนในระดับทรานสคริปโตม ซึ่งช่วยให้สามารถวิเคราะห์เชิงลึก เช่น RNA ภายนอกที่แข่งขันกัน (ceRNA) และการวิเคราะห์ RNA ร่วม สิ่งนี้นับเป็นก้าวเริ่มต้นสู่การกำหนดลักษณะการทำงาน โดยเฉพาะอย่างยิ่งในการคลี่คลายเครือข่ายกฎระเบียบที่เกี่ยวข้องกับการโต้ตอบ ceRNA ที่ใช้ circRNA-miRNA-mRNA
