-
Mpangilio wa viini vya RNA moja
Ukuzaji wa mbinu za kukamata kisanduku kimoja na mbinu maalum za ujenzi wa maktaba, pamoja na mpangilio wa hali ya juu, umeleta mageuzi katika masomo ya usemi wa jeni katika kiwango cha seli. Mafanikio haya yanaruhusu uchanganuzi wa kina na wa kina zaidi wa idadi ya seli changamano, kushinda vikwazo vinavyohusishwa na wastani wa usemi wa jeni juu ya seli zote na kuhifadhi utofauti wa kweli katika makundi haya. Ingawa mpangilio wa RNA wa seli moja (scRNA-seq) una faida zisizoweza kuepukika, hukumbana na changamoto katika tishu fulani ambapo uundaji wa kusimamishwa kwa seli moja huthibitika kuwa mgumu na unahitaji sampuli mpya. Katika BMKGene, tunashughulikia kikwazo hiki kwa kutoa mpangilio wa nyuklia moja ya RNA (snRNA-seq) kwa kutumia teknolojia ya hali ya juu ya 10X Genomics Chromium. Mbinu hii hupanua wigo wa sampuli zinazokubalika kwa uchanganuzi wa nukuu katika kiwango cha seli moja.
Kutenganishwa kwa viini kunakamilishwa kupitia chipu ya Chromium ya 10X Genomics, inayoangazia mfumo wa microfluidis wa idhaa nane na vivuko viwili. Ndani ya mfumo huu, shanga za gel zinazojumuisha barcodes, primers, enzymes, na nucleus moja huingizwa katika matone ya mafuta ya ukubwa wa nanoliter, na kutengeneza Gel Bead-in-Emulsion (GEM). Kufuatia uundaji wa GEM, uchanganuzi wa seli na kutolewa kwa msimbopau hutokea ndani ya kila GEM. Baadaye, molekuli za mRNA hunakiliwa kinyume katika cDNA, ikijumuisha misimbopau 10X na Vitambulishi vya Kipekee vya Molekuli (UMIs). CDNA hizi kisha zinakabiliwa na ujenzi wa maktaba ya mpangilio wa kawaida, kuwezesha uchunguzi thabiti na wa kina wa wasifu wa usemi wa jeni katika kiwango cha seli moja.
Jukwaa: 10× Genomics Chromium na Illumina NovaSeq Platform
-
10x Genomics Visium Transcriptome
Nakala za anga ni teknolojia ya kisasa ambayo inaruhusu watafiti kuchunguza mifumo ya usemi wa jeni ndani ya tishu huku wakihifadhi muktadha wao wa anga. Jukwaa moja lenye nguvu katika kikoa hiki ni 10x Genomics Visium pamoja na mpangilio wa Illumina. Kanuni ya Visium ya 10X iko kwenye chip maalum iliyo na eneo maalum la kukamata ambapo sehemu za tishu zimewekwa. Eneo hili la kunasa lina madoa yenye msimbo, ambayo kila moja inalingana na eneo la kipekee la anga ndani ya tishu. Molekuli za RNA zilizonaswa kutoka kwenye tishu huwekwa lebo ya vitambulishi vya kipekee vya molekuli (UMIs) wakati wa mchakato wa unukuzi wa kinyume. Maeneo haya yenye misimbo mipau na UMI huwezesha upangaji ramani sahihi wa anga na ukadiriaji wa usemi wa jeni katika mwonekano wa seli moja. Mchanganyiko wa sampuli zenye pau na UMIs huhakikisha usahihi na umahususi wa data inayozalishwa. Kwa kutumia teknolojia hii ya Spatial Transcriptomics, watafiti wanaweza kupata uelewa wa kina wa shirika la anga la seli na mwingiliano changamano wa molekuli unaotokea ndani ya tishu, wakitoa ufahamu wa thamani sana katika taratibu zinazohusu michakato ya kibayolojia katika nyanja mbalimbali, ikiwa ni pamoja na oncology, neuroscience, biolojia ya maendeleo, immunology. , na masomo ya mimea.
Jukwaa: Visium ya 10X ya Genomics na Illumina NovaSeq
-
Upangaji wa Urefu Kamili wa mRNA-Nanopore
Ingawa mpangilio wa mRNA unaotegemea NGS ni zana yenye matumizi mengi ya kukadiria usemi wa jeni, utegemezi wake katika usomaji mfupi huzuia ufanisi wake katika uchanganuzi changamano wa nukuu. Kwa upande mwingine, mpangilio wa nanopore hutumia teknolojia iliyosomwa kwa muda mrefu, kuwezesha upangaji wa nakala za urefu kamili za mRNA. Mbinu hii hurahisisha uchunguzi wa kina wa uunganishaji mbadala, uunganishaji wa jeni, uunganishaji wa aina nyingi, na ukadiriaji wa isoform za mRNA.
Mfuatano wa Nanopore, mbinu ambayo inategemea mawimbi ya umeme ya wakati halisi ya nanopore, hutoa matokeo katika muda halisi. Ikiongozwa na protini za injini, DNA yenye nyuzi mbili hufungamana na protini za nanopore zilizopachikwa kwenye filamu ya kibayolojia, inajifungua inapopitia mkondo wa nanopore chini ya tofauti ya voltage. Ishara bainifu za umeme zinazozalishwa na besi tofauti kwenye uzi wa DNA hugunduliwa na kuainishwa katika muda halisi, kuwezesha mpangilio sahihi na endelevu wa nyukleotidi. Mbinu hii bunifu inashinda vizuizi vya kusoma kwa muda mfupi na hutoa jukwaa thabiti la uchanganuzi wa kina wa jenomiki, ikijumuisha masomo changamano ya maandishi, yenye matokeo ya haraka.
Jukwaa: Nanopore PromethION 48
-
Mpangilio wa urefu wa mRNA -PacBio
Ingawa mpangilio wa mRNA unaotegemea NGS ni zana inayoweza kutumika nyingi ya kukadiria usemi wa jeni, utegemezi wake katika usomaji mfupi huzuia matumizi yake katika uchanganuzi changamano wa maandishi. Kwa upande mwingine, mpangilio wa PacBio (Iso-Seq) hutumia teknolojia iliyosomwa kwa muda mrefu, kuwezesha mpangilio wa nakala za urefu kamili za mRNA. Mbinu hii hurahisisha uchunguzi wa kina wa uunganishaji mbadala, uunganishaji wa jeni, na uunganishaji wa aina nyingi. Hata hivyo, kuna chaguo nyingine za ukadiriaji wa usemi wa jeni kutokana na kiasi kikubwa cha data kinachohitajika. Teknolojia ya upangaji ya PacBio inategemea mpangilio wa molekuli moja, wakati halisi (SMRT), kutoa faida tofauti katika kunasa nakala za urefu kamili za mRNA. Mbinu hii ya kibunifu inahusisha kutumia miongozo ya mawimbi ya modi sifuri (ZMWs) na visima vilivyotengenezwa kwa umbo dogo ambavyo huwezesha uchunguzi wa wakati halisi wa shughuli ya polimerasi ya DNA wakati wa mfuatano. Ndani ya hizi ZMWs, polimerasi ya DNA ya PacBio inaunganisha safu ya ziada ya DNA, na kutoa usomaji mrefu ambao unachukua nakala zote za mRNA. Uendeshaji wa PacBio katika hali ya Mfuatano wa Makubaliano ya Mduara (CCS) huongeza usahihi kwa kupanga tena na tena molekuli sawa. Usomaji wa HiFi uliozalishwa una usahihi unaolinganishwa na NGS, unaochangia zaidi katika uchanganuzi wa kina na wa kuaminika wa vipengele changamano vya nakala.
Jukwaa: PacBio Sequel II; PacBio Revio
-
Mpangilio wa mRNA wa yukariyoti-NGS
Ufuataji wa mRNA, teknolojia yenye matumizi mengi, huwezesha uwekaji wasifu wa kina wa nakala zote za mRNA ndani ya seli chini ya hali mahususi. Pamoja na matumizi yake mapana, zana hii ya kisasa inafichua wasifu tata wa usemi wa jeni, miundo ya jeni, na mifumo ya molekuli inayohusishwa na michakato mbalimbali ya kibiolojia. Imekubaliwa sana katika utafiti wa kimsingi, uchunguzi wa kimatibabu, na ukuzaji wa dawa, mpangilio wa mRNA hutoa maarifa juu ya ugumu wa mienendo ya seli na udhibiti wa kijeni, na kuibua udadisi juu ya uwezo wake katika nyanja mbalimbali.
Jukwaa: Illumina NovaSeq X; DNBSEQ-T7
-
Mipangilio ya mRNA isiyo ya Marejeleo-NGS
Upangaji wa mRNA huwezesha uwekaji wasifu wa kina wa manukuu yote ya mRNA ndani ya seli chini ya hali mahususi. Teknolojia hii ya kisasa hutumika kama zana yenye nguvu, inayofunua wasifu tata wa usemi wa jeni, miundo ya jeni, na mifumo ya molekuli inayohusishwa na michakato mbalimbali ya kibiolojia. Imekubaliwa sana katika utafiti wa kimsingi, uchunguzi wa kimatibabu, na ukuzaji wa dawa, mpangilio wa mRNA hutoa maarifa juu ya ugumu wa mienendo ya seli na udhibiti wa kijeni.
Jukwaa: Illumina NovaSeq X; DNBSEQ-T7
-
Mfuatano wa Illumina wa muda mrefu usio na usimbaji
RNA ndefu zisizo na misimbo (lncRNAs) ni ndefu zaidi ya nyukleotidi 200 ambazo zina uwezo mdogo wa kusimba na ni vipengele muhimu ndani ya RNA isiyo ya kusimba. Zinazopatikana katika kiini na saitoplazimu, RNA hizi hutekeleza majukumu muhimu katika udhibiti wa epijenetiki, unukuzi, na baada ya unukuu, ikisisitiza umuhimu wao katika kuunda michakato ya seli na molekuli. Upangaji wa LncRNA ni zana yenye nguvu katika upambanuzi wa seli, Ontogenesis, na magonjwa ya Binadamu.
Jukwaa: Illumina NovaSeq
-
Mpangilio mdogo wa RNA-Illumina
Molekuli ndogo za RNA (sRNA), ni pamoja na microRNAs (miRNAs), RNA ndogo zinazoingilia (siRNAs), na RNA zinazoingiliana piwi (piRNAs). Kati ya hizi, miRNAs, karibu 18-25 nyukleotidi kwa muda mrefu, ni muhimu kujulikana hasa kwa majukumu yao muhimu ya udhibiti katika michakato mbalimbali ya seli. Kwa mifumo ya usemi mahususi na hatua mahususi, miRNA huonyesha uhifadhi wa hali ya juu katika spishi mbalimbali.
Jukwaa: Illumina NovaSeq
-
CircRNA Sequencing-Illumina
Upangaji wa RNA wa duara (circRNA-seq) ni wasifu na kuchanganua RNA za duara, darasa la molekuli za RNA ambazo huunda vitanzi vilivyofungwa kutokana na matukio ya kuunganisha yasiyo ya kisheria, na kuipa RNA hii uthabiti ulioongezeka. Ingawa baadhi ya circRNA zimeonyeshwa kufanya kazi kama sponji ndogo za RNA, zikichukua microRNA na kuzizuia kudhibiti mRNA zinazolengwa, circRNA zingine zinaweza kuingiliana na protini, kurekebisha usemi wa jeni, au kuwa na majukumu katika michakato ya seli. Uchanganuzi wa usemi wa circRNA hutoa maarifa kuhusu majukumu ya udhibiti wa molekuli hizi na umuhimu wao katika michakato mbalimbali ya seli, hatua za ukuaji na hali ya ugonjwa, ikichangia uelewa wa kina wa ugumu wa udhibiti wa RNA katika muktadha wa usemi wa jeni.
-
Mpangilio Mzima wa Nakala - Illumina
Ufuataji wa nukuu nzima unatoa mbinu ya kina ya kuorodhesha molekuli mbalimbali za RNA, ikijumuisha usimbaji (mRNA) na RNA zisizo za kusimba (lncRNA, circRNA, na miRNA). Mbinu hii inachukua nakala nzima ya seli mahususi kwa wakati fulani, ikiruhusu uelewa wa jumla wa michakato ya seli. Pia inajulikana kama "mfuatano wa jumla wa RNA," inalenga kufichua mitandao tata ya udhibiti katika kiwango cha unukuzi, kuwezesha uchanganuzi wa kina kama vile ushindani wa asili wa RNA (ceRNA) na uchanganuzi wa pamoja wa RNA. Hii inaashiria hatua ya awali kuelekea ubainishaji wa utendaji kazi, hasa katika kuibua mitandao ya udhibiti inayohusisha mwingiliano wa ceRNA unaotegemea circRNA-miRNA-mRNA.
