PacBio 2+3 Suluhisho la Urefu Kamili la mRNA
Vipengele
● Muundo wa masomo:
Sampuli iliyounganishwa iliyopangwa na PacBio ili kutambua isoform za manukuu
Sampuli tofauti (nakili na masharti ya kujaribiwa) zikifuatana nazoNGS ili kukadiria usemi wa manukuu
● Upangaji wa PacBio katika hali ya CCS, unaozalisha usomaji wa HiFi
● Mpangilio wa manukuu ya urefu kamili
● Uchambuzi hauhitaji jenomu ya marejeleo; hata hivyo, inaweza kuajiriwa
● Uchanganuzi wa kibiolojia haujumuishi tu kujieleza katika kiwango cha jeni na isoform bali pia uchanganuzi wa lncRNA, muunganisho wa jeni, uunganishaji wa aina nyingi na muundo wa jeni.
Faida
● Usahihi wa Juu: HiFi inasoma kwa usahihi >99.9% (Q30), kulinganishwa na NGS
● Uchanganuzi Mbadala wa Kuunganisha: kupanga nakala zote huwezesha utambulisho wa isoform na uainishaji.
● Mchanganyiko wa Nguvu za PacBio na NGS: kuwezesha ujanibishaji wa usemi katika kiwango cha isoform, kufichua mabadiliko ambayo yanaweza kufichwa wakati wa kuchanganua usemi mzima wa jeni
● Utaalamu wa Kina: kwa rekodi ya kukamilisha zaidi ya miradi 1100 ya nakala ya PacBio ya urefu kamili na kuchakata zaidi ya sampuli 2300, timu yetu huleta uzoefu mwingi kwa kila mradi.
● Usaidizi wa Baada ya Mauzo: Ahadi yetu inaenea zaidi ya kukamilika kwa mradi kwa kipindi cha huduma cha miezi 3 baada ya kuuza. Katika wakati huu, tunatoa ufuatiliaji wa mradi, usaidizi wa utatuzi, na vipindi vya Maswali na Majibu ili kushughulikia maswali yoyote yanayohusiana na matokeo.
Mahitaji ya Sampuli na Uwasilishaji
| Maktaba | Mkakati wa mpangilio | Data ilipendekezwa | Udhibiti wa Ubora |
| Maktaba ya PolyA iliyoboreshwa ya mRNA CCS | Muendelezo wa PacBio II PacBio Revio | 20/40 Gb 5/10 M CCS | Q30≥85% |
| Poly A iliyoboreshwa | Illumina PE150 | 6-10 Gb | Q30≥85% |
Nucleotides
|
| Conc.(ng/μl) | Kiasi (μg) | Usafi | Uadilifu |
| Maktaba ya Illumina | ≥ 10 | ≥ 0.2 | OD260/280=1.7-2.5 OD260/230=0.5-2.5 Uchafuzi wa protini au DNA umepunguzwa au haujaonyeshwa kwenye jeli. | Kwa mimea: RIN≥4.0; Kwa wanyama: RIN≥4.5; 5.0≥28S/18S≥1.0; mwinuko mdogo au hakuna msingi |
| Maktaba ya PacBio | ≥ 100 | ≥ 1.0 | OD260/280=1.7-2.5 OD260/230=0.5-2.5 Uchafuzi wa protini au DNA umepunguzwa au haujaonyeshwa kwenye jeli. | Mimea: RIN≥7.5 Wanyama: RIN≥8.0 5.0≥28S/18S≥1.0; mwinuko mdogo au hakuna msingi |
Uwasilishaji wa Sampuli Uliopendekezwa
Chombo: 2 ml centrifuge tube (bati foil haifai)
Sampuli ya kuweka lebo: Kundi+ kunakili mfano A1, A2, A3; B1, B2, B3.
Usafirishaji:
1. Kavu-barafu:Sampuli zinahitaji kuingizwa kwenye mifuko na kuzikwa kwenye barafu kavu.
2. Mirija ya RNAstable: Sampuli za RNA zinaweza kukaushwa kwenye mirija ya kusawazisha ya RNA (km RNAstable®) na kusafirishwa kwenye joto la kawaida.
Inajumuisha uchambuzi ufuatao:
Udhibiti wa ubora wa data ghafi
Uchambuzi Mbadala wa Polyadenylation (APA)
Uchambuzi wa manukuu ya Fusion
Uchanganuzi Mbadala wa Kuunganisha
Uchanganuzi wa Kulinganisha wa Orthologi za Nakala Moja ya Universal (BUSCO).
Uchambuzi wa manukuu ya riwaya: utabiri wa mfuatano wa usimbaji (CDS) na ufafanuzi wa kiutendaji
Uchambuzi wa lncRNA: utabiri wa lncRNA na malengo
Kitambulisho cha MicroSatelite (SSR)
Uchambuzi wa Hati Zilizoonyeshwa kwa Tofauti (DETs).
Uchambuzi wa Jeni Zilizoonyeshwa kwa Tofauti (DEGs).
Ufafanuzi wa kiutendaji wa DEGs na DETs
Uchambuzi wa BUSCO
Uchanganuzi Mbadala wa Kuunganisha
Uchambuzi Mbadala wa Polyadenylation (APA)
Jeni Zilizoonyeshwa kwa Tofauti (DEGs) na Nakala (DETs9 anlaysis
Mitandao ya mwingiliano wa protini-protini ya DET na DEGs
Gundua maendeleo yanayowezeshwa na mpangilio wa mRNA wa BMKGene wa PacBio 2+3 kupitia mkusanyo ulioratibiwa wa machapisho.
Chao, Q. et al. (2019) 'Mienendo ya ukuzaji wa nakala ya shina la Populus', Jarida la Baiolojia ya Mimea, 17(1), uk. 206–219. doi: 10.1111/PBI.12958.
Deng, H. et al. (2022) 'Mabadiliko Makubwa katika Maudhui ya Asidi ya Ascorbic wakati wa Ukuzaji wa Matunda na Uvunaji wa Actinidia latifolia (Zao la Matunda lenye Utajiri wa Ascorbate) na Mbinu Zilizounganishwa za Molekuli', Jarida la Kimataifa la Sayansi ya Molekuli, 23(10), uk. 5808. doi: 10.3390/IJMS23105808/S1.
Hua, X. et al. (2022) 'Utabiri mzuri wa jeni za njia ya kibayolojia inayohusika katika polyphyllins hai huko Paris polyphylla', Biolojia ya Mawasiliano 2022 5:1, 5(1), uk. 1–10. doi: 10.1038/s42003-022-03000-z.
Liu, M. na wengine. (2023) 'PacBio Iso-Seq pamoja na Illumina RNA-Seq Uchambuzi wa Tuta absoluta (Meyrick) Transcriptome na Cytochrome P450 Genes', Wadudu, 14(4), p. 363. doi: 10.3390/INSECTS14040363/S1.
Wang, Lijun na wengine. (2019) 'Utafiti wa uchangamano wa nukuu kwa kutumia uchanganuzi wa wakati halisi wa PacBio pamoja na mpangilio wa Illumina RNA kwa ufahamu bora wa usanisi wa asidi ya ricinoleic katika Ricinus communis', BMC Genomics, 20(1), ukurasa wa 1–17. doi: 10.1186/S12864-019-5832-9/FIGURES/7.
