Sekuenca e ARN-së me një bërthamë
Skema Teknike
Izolimi i bërthamave arrihet nga 10× Genomics Chromium™, i cili përbëhet nga një sistem mikrofluidik me tetë kanale me kryqëzime të dyfishta. Në këtë sistem, një rruaza xhel me barkode dhe primer, enzima dhe një bërthamë e vetme janë të kapsuluara në pikë vaji me madhësi nanolitri, duke gjeneruar Gel Bead-in-Emulsion (GEM). Pasi të formohet GEM, liza e qelizave dhe lirimi i barkodeve kryhen në çdo GEM. mRNA transkriptohen në të kundërt në molekula cDNA me barkode 10× dhe UMI, të cilat më tej i nënshtrohen ndërtimit të bibliotekës standarde të sekuencës.
Veçoritë
● Përgatitja e suspensionit me një bërthamë nga indet e ngrira
● Formimi i Xhel Bead-in-Emulsion (GEM) i ndjekur nga sinteza e cDNA
● Çdo rruazë në një GEM është e ngarkuar me abetare të përbërë nga 4 seksione:
bishti poli(dT) për priming mRNA dhe sintezën e cDNA,
Identifikuesi unik molekular (UMI) për të korrigjuar paragjykimet e amplifikimit
10x barkod
Sekuenca lidhëse e primerit të sekuencave të leximit të pjesshëm 1
Avantazhet
Sekuenca e ARN-së me një bërthamë anashkalon kufizimet e renditjes së ARN-së me një qelizë të vetme, duke mundësuar:
● Përdorimi i mostrave të ngrira dhe jo vetëm i kufizuar në mostrat e freskëta
● Stresi i ulët i qelizave të ngrira kur krahasohet me trajtimin enzimatik të qelizave të freskëta, i reflektuar në të dhënat e transkriptimit në formën e gjeneve më pak të shkaktuara nga stresi
● Nuk ka nevojë për heqje paraprake të rruazave të kuqe të gjakut
● Diametri i pakufizuar i qelizave
● Një grup i madh mostrash që janë të pranueshme për analizë, duke përfshirë llojet komplekse dhe të brishta të indeve që janë të prirur ndaj grumbullimit ose shkatërrimit të qelizave gjatë shpërbërjes së indeve
Mostrat që nuk mund të analizohen me sekuencën e ARN-së me një qelizë të vetme dhe janë të pranueshme për sekuencën e ARN-së me një bërthamë të vetme:
| Qelizë / Ind | Arsyeja |
| Pafreskoni indet e ngrira | Nuk mund të merrni organizata të freskëta ose të ruajtura prej kohësh |
| Qeliza muskulore, megakariocitet, yndyra… | Diametri i qelizës është shumë i madh për të hyrë në instrument |
| Mëlçia… | Shumë e brishtë për t'u thyer, e paaftë për të dalluar qelizat e vetme |
| Qeliza neurone, truri… | Më e ndjeshme, e lehtë për t'u stresuar, do të ndryshojë rezultatet e renditjes |
| Pankreasi, tiroidja… | I pasur me enzima endogjene, që ndikojnë në prodhimin e suspensionit njëqelizor |
Një bërthamë vs njëqelizore
| Njëbërthamë | Njëqelizore |
| Diametri i pakufizuar i qelizave | Diametri i qelizës: 10-40 μm |
| Materiali mund të jetë ind i ngrirë | Materiali duhet të jetë ind i freskët |
| Stresi i ulët i qelizave të ngrira | Trajtimi me enzimë mund të shkaktojë reaksion të stresit të qelizave |
| Nuk ka nevojë të hiqet qelizat e kuqe të gjakut | Qelizat e kuqe të gjakut duhet të hiqen |
| Bërthamore shpreh bioinformacion | E gjithë qeliza shpreh bioinformacion |
Specifikimet
| Kërkesat e mostrës | Biblioteka | Strategjia e renditjes | Të dhënat e rekomanduara | Kontrolli i cilësisë |
| Indet e kafshëve ≥ 200 mg Indet bimore ≥ 400 mg | Biblioteka 10x Genomics sn cDNA | Ndriçues PE150 | 100 mijë PE lexime për qelizë (100-200 Gb) | 700-1200 bërthama/μl dhe integriteti i bërthamave të vëzhguara nën mikroskop |
Për më shumë detaje mbi udhëzimet për përgatitjen e mostrës dhe rrjedhën e punës së shërbimit, ju lutemi mos ngurroni të flisni me aekspert BMKGENE
Rrjedha e punës së shërbimit
Përfshin analizën e mëposhtme:
● Kontrolli i cilësisë: numri i qelizave, zbulimi i gjeneve, identifikimi i saktë i qelizave, molekulat e ARN-së dhe kuantifikimi i shprehjes
● Analiza e mostrës së brendshme:
Grumbullimi i qelizave dhe shënimi i grupeve
Analiza e shprehjeve diferenciale: identifikimi i DEG-ve në grupime
Shënim funksional dhe pasurimi i DEG-ve të grupimit
● Analiza ndër-grupore:
Kombinimi i të dhënave
Analiza e shprehjeve diferenciale: identifikimi i DEG-ve në grupe
Shënim funksional dhe pasurimi i grupeve DEG
● Analiza e avancuar:
Analiza e ciklit qelizor
Analiza pseudokohore
Analiza e komunikimit celular (CellPhoneDB)
Analiza e pasurimit të grupit të gjeneve (GSEA)
Analiza e mostrës së brendshme
Grumbullimi i qelizave:
Analiza e shprehjeve diferenciale: DEG-të e grupimit
Analiza ndër-grupore
Analiza e shprehjeve diferenciale: DEG në grup
Analiza e avancuar:
Analiza pseudokohore:
Analiza e ciklit qelizor:
Eksploroni përparimet e lehtësuara nga shërbimet e renditjes së ARN-së me një bërthamë të BMKGene nga 10X Chromium në këto botime të paraqitura:
Wang, L. et al. (2021) 'Analiza transkriptomike me një qelizë zbulon peizazhin imunitar të mushkërive në përkeqësimin e astmës rezistente ndaj steroideve',Procedurat e Akademisë Kombëtare të Shkencave të Shteteve të Bashkuara të Amerikës, 118 (2), f. e2005590118. doi: 10.1073/pnas.2005590118
Zheng, H. et al. (2022) "Një rrjet rregullator global për shprehjen e parregulluar të gjeneve dhe sinjalizimin jonormal metabolik në qelizat imune në mikromjedisin e sëmundjes së Graves dhe tiroiditit të Hashimotos",Kufijtë në imunologji, 13, f. 879824. doi: 10.3389/FIMMU.2022.879824/BIBTEX.
Tian, H. et al. (2023) 'Transkriptomi me një qelizë zbulon heterogjenitetin dhe përgjigjet imune të leukociteve pas vaksinimit me Edwardsiella tarda të inaktivizuar në fllunder (Paralichthys olivaceus)',Akuakultura, 566, f. 739238. doi: 10.1016/J.AKUAKULTURE.2023.739238.
Yu, Y. et al. (2023) 'Terapia fotodinamike përmirëson rezultatin e frenuesve të pikave të kontrollit imunitar nëpërmjet rimodelimit të imunitetit anti-tumor te pacientët me kancer gastrik',Kanceri i stomakut, 26 (5), f. 798–813. doi: 10.1007/S10120-023-01409-X/METRICS.
