Izolacijo jeder doseže 10× Genomics Chromium™, ki je sestavljen iz osemkanalnega mikrofluidnega sistema z dvojnimi križišči. V tem sistemu so kroglice gela s črtnimi kodami in temeljnim premazom, encimi in eno samo jedro vkapsulirane v kapljico olja v velikosti nanolitra, kar ustvarja gelsko kroglico v emulziji (GEM). Ko se GEM oblikuje, se v vsakem GEM izvede celična liza in sprostitev črtnih kod. mRNA se reverzno prepiše v molekule cDNA z 10 × črtnimi kodami in UMI, ki so nadalje predmet standardne konstrukcije knjižnice sekvenciranja.
● Priprava enojedrne suspenzije iz zamrznjenih tkiv
● Tvorba gelskih kroglic v emulziji (GEM), ki ji sledi sinteza cDNA
● Vsaka kroglica v GEM je napolnjena s primerji, sestavljenimi iz 4 delov:
poli(dT) rep za pripravo mRNA in sintezo cDNA,
Edinstveni molekularni identifikator (UMI) za popravljanje pristranskosti pomnoževanja
10x črtna koda
Vezavno zaporedje začetnika sekvenciranja delnega branja 1
Sekvenciranje enojedrne RNA zaobide omejitve sekvenciranja enocelične RNA in omogoča:
● Uporaba zamrznjenih vzorcev in ne le omejena na sveže vzorce
● Nizek stres zamrznjenih celic v primerjavi z encimsko obdelavo svežih celic, kar se odraža v podatkih transkriptoma v obliki manj stresno povzročenih genov
● Predhodna odstranitev rdečih krvničk ni potrebna
● Neomejen premer celice
● Velik nabor vzorcev, ki so primerni za analizo, vključno s kompleksnimi in krhkimi vrstami tkiv, ki so nagnjena k združevanju ali uničenju celic med disociacijo tkiva
Celica / tkivo | Razlog |
Nesveže zamrznjeno tkivo | Ni mogoče pridobiti svežih ali dolgo shranjenih organizacij |
Mišična celica, megakariocit, maščoba… | Premer celice je prevelik za vstop v instrument |
Jetra… | Preveč krhka, da bi se zlomila, ne more razlikovati posameznih celic |
Nevronska celica, možgani… | Bolj občutljiv, enostaven za stres, bo spremenil rezultate zaporedja |
Trebušna slinavka, ščitnica… | Bogat z endogenimi encimi, ki vplivajo na proizvodnjo suspenzije posameznih celic |
Enojedren | Enocelični |
Neomejen premer celice | Premer celice: 10-40 μm |
Material je lahko zamrznjeno tkivo | Material mora biti sveže tkivo |
Nizek stres zamrznjenih celic | Zdravljenje z encimi lahko povzroči celično stresno reakcijo |
Rdečih krvničk ni treba odstraniti | Rdeče krvničke je treba odstraniti |
Jedro izraža bioinformacijo | Celotna celica izraža bioinformacijo |
Vzorčne zahteve | Knjižnica | Strategija zaporedja | Priporočeni podatki | Kontrola kakovosti |
Živalsko tkivo ≥ 200 mg Rastlinsko tkivo ≥ 400 mg | 10x Genomics sn cDNA knjižnica | Ilumina PE150 | 100K PE branj na celico (100-200 Gb) | 700-1200 jeder/μl in celovitost jeder opazovana pod mikroskopom |
Za več podrobnosti o navodilih za pripravo vzorcev in poteku storitev se obrnite na aBMKGENE strokovnjak
Vključuje naslednjo analizo:
● Nadzor kakovosti: število celic, odkrivanje genov, natančna identifikacija celic, molekul RNA in kvantifikacija izražanja
● Notranja analiza vzorca:
Gručenje celic in označevanje gruč
Diferencialna ekspresijska analiza: identifikacija DEG v grozdih
Funkcionalna anotacija in obogatitev DEG grozdov
● Analiza med skupinami:
Kombinacija podatkov
Diferencialna ekspresijska analiza: identifikacija DEG v skupinah
Funkcionalna anotacija in obogatitev skupinskih DEG
● Napredna analiza:
Analiza celičnega cikla
Analiza psevdočasa
Analiza celične komunikacije (CellPhoneDB)
Analiza obogatitve genskega nabora (GSEA)
Analiza notranjega vzorca
Združevanje celic:
Diferencialna ekspresijska analiza: grozdni DEG
Analiza med skupinami
Diferencialna ekspresijska analiza: skupinski DEG
Napredna analiza:
Analiza psevdočasa:
Analiza celičnega cikla:
Raziščite napredek, ki ga omogoča BMKGene s storitvami sekvenciranja enojedrne RNA s strani 10X Chromium v teh predstavljenih publikacijah:
Wang, L. et al. (2021) 'Enocelična transkriptomska analiza razkriva imunsko pokrajino pljuč pri poslabšanju astme, odporne na steroide',Zbornik Nacionalne akademije znanosti Združenih držav Amerike, 118(2), str. e2005590118. doi: 10.1073/pnas.2005590118
Zheng, H. et al. (2022) 'Globalno regulativno omrežje za disregulirano izražanje genov in nenormalno presnovno signalizacijo v imunskih celicah v mikrookolju Gravesove bolezni in Hashimotovega tiroiditisa',Meje v imunologiji, 13, str. 879824. doi: 10.3389/FIMMU.2022.879824/BIBTEX.
Tian, H. et al. (2023) 'Enocelični transkriptom razkrije heterogenost in imunske odzive levkocitov po cepljenju z inaktivirano Edwardsiella tarda pri iverki (Paralichthys olivaceus)',ribogojstvo, 566, str. 739238. doi: 10.1016/J.AQUACULTURE.2023.739238.
Yu, Y. et al. (2023) "Fotodinamična terapija izboljša izid zaviralcev imunskih kontrolnih točk s preoblikovanjem protitumorske imunosti pri bolnikih z rakom želodca",Rak želodca, 26(5), str. 798–813. doi: 10.1007/S10120-023-01409-X/METRIKE.