Jednojadrové sekvenovanie RNA
Technická schéma
Izolácia jadier je dosiahnutá pomocou 10× Genomics Chromium™, ktorý pozostáva z osemkanálového mikrofluidného systému s dvojitým krížením. V tomto systéme sú gélové guľôčky s čiarovými kódmi a primérom, enzýmy a jedno jadro zapuzdrené v nanolitrových kvapkách oleja, čím sa vytvorí gélová guľôčka v emulzii (GEM). Po vytvorení GEM sa v každom GEM uskutoční bunková lýza a uvoľnenie čiarových kódov. mRNA sú reverzne transkribované do cDNA molekúl s 10x čiarovými kódmi a UMI, ktoré sú ďalej predmetom štandardnej konštrukcie sekvenčnej knižnice.
Vlastnosti
● Príprava jednojadrovej suspenzie zo zmrazených tkanív
● Vytvorenie gélovej guľôčky v emulzii (GEM), po ktorej nasleduje syntéza cDNA
● Každá guľôčka v GEM je naplnená primermi zloženými zo 4 sekcií:
poly(dT) chvost na aktiváciu mRNA a syntézu cDNA,
Jedinečný molekulárny identifikátor (UMI) na opravu skreslenia amplifikácie
10x čiarový kód
Väzbová sekvencia čiastočného čítania 1 sekvenačného priméru
Výhody
Jednojadrové sekvenovanie RNA obchádza obmedzenia jednobunkového sekvenovania RNA, čo umožňuje:
● Použitie zmrazených vzoriek nie je obmedzené len na čerstvé vzorky
● Nízky stres zmrazených buniek v porovnaní s enzymatickým ošetrením čerstvých buniek, čo sa odráža v transkriptómových údajoch vo forme génov vyvolaných menej stresom
● Nie je potrebné predchádzajúce odstraňovanie červených krviniek
● Neobmedzený priemer bunky
● Veľké množstvo vzoriek, ktoré sú vhodné na analýzu, vrátane komplexných a krehkých typov tkanív, ktoré sú náchylné na zhlukovanie alebo deštrukciu buniek počas disociácie tkaniva
Vzorky, ktoré nemožno analyzovať jednobunkovým sekvenovaním RNA a sú vhodné na sekvenovanie RNA s jedným jadrom:
| Bunka / tkanivo | Dôvod |
| Nečerstvé zmrazené tkanivo | Nie je možné získať nové alebo dlho uložené organizácie |
| Svalové bunky, megakaryocyty, tuk... | Priemer bunky je príliš veľký na to, aby sa dostal do prístroja |
| Pečeň… | Príliš krehký na to, aby sa zlomil, nedokáže rozlíšiť jednotlivé bunky |
| Neurónová bunka, mozog… | Citlivejší, ľahko stresovateľný, zmení výsledky sekvenovania |
| Pankreas, štítna žľaza… | Bohaté na endogénne enzýmy ovplyvňujúce produkciu suspenzie jednotlivých buniek |
Jednojadro vs jednobunkové
| Jednojadrový | Jednobunková |
| Neobmedzený priemer bunky | Priemer bunky: 10-40 μm |
| Materiálom môže byť zmrazené tkanivo | Materiál musí byť čerstvý papier |
| Nízky stres zmrazených buniek | Enzýmová liečba môže spôsobiť bunkovú stresovú reakciu |
| Nie je potrebné odstraňovať žiadne červené krvinky | Je potrebné odstrániť červené krvinky |
| Jadrové vyjadruje bioinformácie | Celá bunka exprimuje bioinformácie |
Špecifikácie
| Vzorové požiadavky | Knižnica | Stratégia sekvenovania | Odporúčané údaje | Kontrola kvality |
| Živočíšne tkanivo ≥ 200 mg Rastlinné tkanivo ≥ 400 mg | 10x Genomics sn cDNA knižnica | Illumina PE150 | 100K PE čítaní na bunku (100 – 200 Gb) | 700-1200 jadier/μl a integrita jadier pozorovaná pod mikroskopom |
Ak chcete získať viac podrobností o návode na prípravu vzoriek a pracovnom postupe služieb, neváhajte a porozprávajte sa s aExpert BMKGENE
Tok servisných prác
Zahŕňa nasledujúcu analýzu:
● Kontrola kvality: počet buniek, detekcia génov, presná identifikácia buniek, molekúl RNA a kvantifikácia expresie
● Analýza vnútornej vzorky:
Klastrovanie buniek a anotácia klastrov
Analýza diferenciálnej expresie: identifikácia stupňov v zhlukoch
Funkčná anotácia a obohatenie klastrových stupňov
● Medziskupinová analýza:
Kombinácia údajov
Analýza diferenciálnej expresie: identifikácia stupňov v skupinách
Funkčná anotácia a obohatenie skupinových stupňov
● Pokročilá analýza:
Analýza bunkového cyklu
Pseudočasová analýza
Analýza mobilnej komunikácie (CellPhoneDB)
Analýza obohatenia génovej sady (GSEA)
Analýza vnútornej vzorky
Zhlukovanie buniek:
Analýza diferenciálnej expresie: klastrové stupne
Medziskupinová analýza
Analýza diferenciálnej expresie: Skupinové stupne
Pokročilá analýza:
Pseudočasová analýza:
Analýza bunkového cyklu:
Preskúmajte pokroky, ktoré umožňujú služby sekvenovania jednojadrovej RNA spoločnosti BMKGene od spoločnosti 10X Chromium v týchto odporúčaných publikáciách:
Wang, L. a kol. (2021) „Jednobunková transkriptomická analýza odhaľuje imunitnú krajinu pľúc pri exacerbácii astmy rezistentnej na steroidy“,Zborník Národnej akadémie vied Spojených štátov amerických118(2), s. e2005590118. doi: 10.1073/pnas.2005590118
Zheng, H. a kol. (2022) „Globálna regulačná sieť pre dysregulovanú génovú expresiu a abnormálnu metabolickú signalizáciu v imunitných bunkách v mikroprostredí Gravesovej choroby a Hashimotovej tyreoiditídy“,Hranice v imunológii, 13, str. 879824. doi: 10.3389/FIMMU.2022.879824/BIBTEX.
Tian, H. a kol. (2023) „Jednobunkový transkriptóm odhaľuje heterogenitu a imunitné odpovede leukocytov po očkovaní inaktivovanou Edwardsiella tarda u platesy (Paralichthys olivaceus)“,Akvakultúra, 566, s. 739238. doi: 10.1016/J.AQUACULTURE.2023.739238.
Yu, Y. a kol. (2023) „Fotodynamická terapia zlepšuje výsledok inhibítorov imunitného kontrolného bodu prostredníctvom prestavby protinádorovej imunity u pacientov s rakovinou žalúdka“,Rakovina žalúdka, 26 (5), s. 798-813. doi: 10.1007/S10120-023-01409-X/METRICS.
