Roztok PacBio 2+3 s plnou dĺžkou mRNA
Vlastnosti
● Návrh štúdie:
Spoločná vzorka sekvenovaná pomocou PacBio na identifikáciu izoforiem transkriptu
Samostatné vzorky (replikáty a podmienky, ktoré sa majú testovať) sekvenované pomocouNGS na kvantifikáciu expresie transkriptu
● Sekvenovanie PacBio v režime CCS, generovanie HiFi čítania
● Sekvenovanie prepisov v plnej dĺžke
● Analýza nevyžaduje referenčný genóm; môže sa však použiť
● Bioinformatická analýza zahŕňa nielen expresiu na úrovni génov a izoforiem, ale aj analýzu lncRNA, génových fúzií, polyadenyláciu a génovú štruktúru
Výhody
● Vysoká presnosť: HiFi číta s presnosťou >99,9 % (Q30), porovnateľnou s NGS
● Analýza alternatívnych spojov: sekvenovanie všetkých transkriptov umožňuje identifikáciu a charakterizáciu izoforiem.
● Kombinácia silných stránok PacBio a NGS: umožnenie kvantifikácie expresie na úrovni izoforiem, odhalenie zmeny, ktorá môže byť maskovaná pri analýze expresie celého génu
● Rozsiahle odborné znalosti: so záznamom dokončenia viac ako 1100 celovečerných projektov prepisu PacBio a spracovaním viac ako 2300 vzoriek prináša náš tím do každého projektu bohaté skúsenosti.
● Podpora po predaji: náš záväzok presahuje dokončenie projektu s 3-mesačným obdobím popredajného servisu. Počas tohto obdobia ponúkame sledovanie projektu, pomoc pri riešení problémov a stretnutia otázok a odpovedí na riešenie akýchkoľvek otázok súvisiacich s výsledkami.
Vzorové požiadavky a doručenie
| Knižnica | Stratégia sekvenovania | Odporúčané údaje | Kontrola kvality |
| Knižnica mRNA CCS obohatená o PolyA | Pokračovanie PacBio II PacBio Revio | 20/40 Gb 5/10 M CCS | Q30 ≥ 85 % |
| Obohatené o Poly A | Illumina PE150 | 6-10 Gb | Q30 ≥ 85 % |
Nukleotidy
|
| Konc. (ng/μl) | množstvo (μg) | Čistota | bezúhonnosť |
| Knižnica Illumina | ≥ 10 | ≥ 0,2 | OD260/280 = 1,7-2,5 OD260/230 = 0,5-2,5 Obmedzená alebo žiadna kontaminácia proteínmi alebo DNA na géli. | Pre rastliny: RIN≥4,0; Pre zvieratá: RIN≥4,5; 5,0≥28S/18S≥1,0; obmedzená alebo žiadna základná elevácia |
| Knižnica PacBio | ≥ 100 | ≥ 1,0 | OD260/280 = 1,7-2,5 OD260/230 = 0,5-2,5 Obmedzená alebo žiadna kontaminácia proteínmi alebo DNA na géli. | Rastliny: RIN≥7,5 Zvieratá: RIN ≥ 8,0 5,0≥28S/18S≥1,0; obmedzená alebo žiadna základná elevácia |
Odporúčané doručenie vzorky
Nádoba: 2 ml centrifugačná skúmavka (neodporúča sa cínová fólia)
Označenie vzoriek: Skupina+replikácia napr. A1, A2, A3; B1, B2, B3.
Zásielka:
1. Suchý ľad:Vzorky je potrebné zabaliť do vriec a pochovať v suchom ľade.
2. Skúmavky RNAstable: Vzorky RNA možno vysušiť v skúmavke na stabilizáciu RNA (napr. RNAstable®) a odoslať pri izbovej teplote.
Zahŕňa nasledujúcu analýzu:
Kontrola kvality nespracovaných údajov
Alternatívna polyadenylačná analýza (APA)
Analýza fúzneho transkriptu
Analýza alternatívneho spájania
Porovnávacia analýza univerzálnych jednokópiových ortológov (BUSCO).
Nová analýza transkriptu: predikcia kódujúcich sekvencií (CDS) a funkčná anotácia
Analýza lncRNA: predikcia lncRNA a cieľov
MicroSatelite Identification (SSR)
Analýza diferenciálne vyjadrených transkriptov (DET).
Analýza diferenciálne exprimovaných génov (DEGs).
Funkčná anotácia DEG a DET
BUSCO analýza
Analýza alternatívneho spájania
Alternatívna polyadenylačná analýza (APA)
Rozdielne vyjadrené gény (DEGs) a transkripty (analýza DETs9
Interakčné siete proteín-proteín DET a DEG
Preskúmajte pokroky, ktoré umožňuje sekvenovanie mRNA plnej dĺžky PacBio 2+3 od BMKGene prostredníctvom kurátorskej zbierky publikácií.
Chao, Q. a kol. (2019) „Vývojová dynamika transkriptómu kmeňa Populus“, Plant Biotechnology Journal, 17 (1), s. 206–219. doi: 10.1111/PBI.12958.
Deng, H. a kol. (2022) „Dynamické zmeny v obsahu kyseliny askorbovej počas vývoja ovocia a dozrievania Actinidia latifolia (plodina ovocia bohatá na askorbát) a súvisiace molekulárne mechanizmy“, International Journal of Molecular Sciences, 23(10), s. 5808. doi: 10.3390/IJMS23105808/S1.
Hua, X. a kol. (2022) „Efektívna predpoveď génov biosyntetickej dráhy zapojených do bioaktívnych polyfylínov v parížskej polyphylle“, Communications Biology 2022 5: 1, 5 (1), s. 1–10. doi: 10.1038/s42003-022-03000-z.
Liu, M. a kol. (2023) 'Kombinovaná PacBio Iso-Seq a Illumina RNA-Seq analýza transkriptómu Tuta absoluta (Meyrick) a génov cytochrómu P450', Insects, 14(4), s. 363. doi: 10.3390/INSECTS14040363/S1.
Wang, Lijun a kol. (2019) „Prieskum komplexnosti transkriptomu pomocou jednomolekulovej analýzy PacBio v reálnom čase v kombinácii so sekvenovaním Illumina RNA na lepšie pochopenie biosyntézy kyseliny ricínolejovej v Ricinus communis“, BMC Genomics, 20(1), s. 1–17. doi: 10.1186/S12864-019-5832-9/FIGURES/7.
