Ľudská genomika
genetika prírody
Dlhodobé sekvenovanie identifikuje opakované expanzie GGC v Notch2NLC spojené s neuronálnym intranukleárnym inklúznym ochorením
ONT RESECENCING | Illumina Celé exomové sekvenovanie Sekvenovanie cielene CRISPR-CAS9 ONT RNA-seq | ONT 5MC Metylačné volanie
Vrcholy
1. Analýza väzieb na veľkej rodine NIID bola identifikovaná dva prepojené regióny.
2.NAT na báze dlhého čítania a CAS-9 sprostredkovaného obohatenia ONT sekvenovanie zistilo potenciálnu genetickú príčinu NIID, GGC opakované expanzie GGC v 5 'UTR Notch2NLC. Táto štúdia uviedla, že po prvýkrát, ktoré sa vyvíjali prostredníctvom segmentových duplikácií, opakovane expanzie v génoch špecifických pre človeka.
3.RNA sekvenovanie odhalilo abnormálne antisense transkripty na začiatku alebo vo vnútri opakovaných expanzných oblastí GGC v Notch2NLC.
Pozadie
NEuronálne intranukleárne inklúzne ochorenie (NIID) je progresívne a smrteľné neurodegeneratívne ochorenie, ktoré sa vyznačuje prítomnosťou eozinofilného intranukleárneho intranukleárneho intranukleárneho intranukleárneho intranukleárneho systému v centrálnych a periférnych nervových systémoch. Jeho vysoko variabilné klinické prejavy vyvolávajú veľké ťažkosti pri diagnostike až do zavedenia biopsie kože. Metódy založené na histopatológii však stále trpia nesprávnou diagnózou, ktorá požaduje genetické porozumenie NIID.
Úspechy
Analýza prepojenia
SNa veľkej rodine NIID (13 postihnutých a 7 neovplyvnených členov) sa uskutočnili sekvenovanie celého genómu (WGS) a celé sekvenovanie exómov (WES). Analýza prepojenia na SNP extrahovaných z týchto údajov odhalila iba dve prepojené oblasti: oblasť 3,5 MB pri 1P36,31-P36.22 (maximálny LOD = 2,32) a oblasť 58,1 MB pri 1p22.1-q21.3 (maximálne LOD: 4,21 ). V týchto prepojených oblastiach však neboli identifikované žiadne patogénne SNP alebo CNV.
GGC Opakované expanzie v Notch2nlc
NSekvenovanie založené na Anopore bolo spracované na 13 postihnutých a 4 neovplyvnených členov z 8 rodín (ďalší dotknutý člen bol sekvenovaný pomocou PACBIO Long Read Sekvencing Platform.). Údaje o dlhom prečítaní odhalili opakované expanzie GGC spojené s ochorením v 5 'UTR mapovania génového génu Notch2NLC na 58,1 MB prepojenú oblasť (obrázok 1). Tieto opakované expanzie boli tiež identifikované vo všetkých 40 sporadických prípadoch NIID testovaných pomocou RP-PCR.
CNa dosiahnutie vyššieho čítania o opakovaní Notch2NLC (100 x-1 795 x) sa použilo sekvenovanie cieľov sprostredkovaného AS-9 na platforme nanopore. Tieto konsenzuálne sekvencie dobre súhlasili s predchádzajúcimi zisteniami o opakovaných rozšíreniach GGC. Navyše {(GGA) N (GGC) N} N opakovania boli identifikované ako potenciálny genetický marker pre fenotyp s dominantným slabosťou (obrázok 2).
Obrázok 1. Opakovaná expanzia spojená s chorobami identifikovaná na exóne 1 izoforiem Notch2NLC.
Obrázok 2. Konsenzuálne sekvencie opakovania NPTCH2NLC u pacientov s NIID s (*) alebo bez fenotypu s dominantnou slabosťou
NGény OTCH2NL sú gény špecifické pre človeka, o ktorých sa predpokladá, že zohrávajú životne dôležitú úlohu pri vývoji ľudského mozgu a neurologických chorobách. Avšak tri gény súvisiace s Notch2 (Notch2NLA, Notch2NLB a Notch2NLC) s identitou sekvencie> 99,1% sa nevyriešili až do najnovšieho zhromaždenia ľudského genómu. Sekvenovanie bez syntézy a dlhé čítanie na platforme nanopórov preukázali pozoruhodné výhody v riešení oblastí s vysokou podobnosťou a (GGC) N opakuje so 100% bohatými na GC.
GGC Opakované expanzie v Notch2nlc
TSekvenovanie Ranscriptome bolo spracované na 2 postihnutých a 2 neovplyvnených členov. Normalizovaná hĺbka čítania bola vypočítaná na zmysle a antisense vláknach v proti prúdu od prvých exónov paralogov Notch2NL. Abnormálne transkripty anti-sense boli nájdené iba v postihnutých prípadoch, ktoré sedia na začiatku alebo vo vnútri opakovanej expanznej oblasti (fialové píky v F1-14 a F1-16 na obrázku 3.). Okrem toho bolo identifikovaných 54 stupňov a všetky boli obohatené v termínoch GO a MPO súvisiacich s neuronálnymi funkciami.
Obrázok 3. Normalizovaná hĺbka čítania na prúde od prvého exónu Notch2NLC v nedotknutých (vyššie) a ovplyvnených (nižšie) prípadoch.
Technológia
Oxford Nanopore Teghnologies (ONT)
NSekvenovanie anopore sa odlišuje od iných sekvenčných platforiem v tom, že nukleotidy sa čítajú priamo bez procesu syntézy DNA. Keďže jediná reťazová DNA prechádza proteínovými pórami nano-veľkosť (nanopór), rôzne nukleotidy generujú rôzne iónové prúdy, ktoré sa môžu zachytiť a prenášať do sekvencie báz. Samotná platforma sekvenovania ONT nevykazuje zjavný technický limit na dĺžku čítania DNA. Preto sú k dispozícii ultra dlhé čítania (ULR) na zostavenie genómu s vysokou kvalitou. Okrem toho tieto extrémne dlhé čítania, ktoré sú dostatočne dlhé na to, aby krížili zložité sekvenčné prvky alebo štrukturálne variácie, pomáhajú prekonať obmedzenia sekvenovania krátkodobého čítania tu.
Sekvenovanie nanopore
Identifikácia variácie štruktúry (SV)
SSekvenovanie bez ynthézy prevažne zachované informácie o metylácii DNA na šablóne. Metylované A, T, C a G generujú odlišné iónové prúdy od nemetylovaných, ktoré je možné čítať priamo pomocou platformy. Sekvenovanie nanopore umožňuje profilovanie celého genómu 5MC a 6MA pri rozlíšení s jedným nukleotidom.
Referencia
Jun Sone, et. al. Dlhodobé sekvenovanie identifikuje opakované expanzie GGC v Notch2NLC spojené s neuronálnym intranukleárnym inklúznym ochorením. Nature Genetics (2019)
Technológia Cieľom je zdieľať najnovšiu úspešnú aplikáciu rôznych vysoko výkonných technológií sekvencovania v rôznych reseach aréne, ako aj skvelé nápady v experimentálnom návrhu a získavaní údajov.
Čas príspevku: Jan-06-2022