Секвенирование одноядерной РНК
Техническая схема
Изоляция ядер достигается с помощью 10× Genomics Chromium™, который представляет собой восьмиканальную микрофлюидную систему с двойными пересечениями. В этой системе шарики геля со штрих-кодами и праймером, ферментами и одним ядром инкапсулируются в каплю масла размером нанолитр, образуя гель-шарики в эмульсии (GEM). После формирования GEM в каждом GEM происходит лизис клеток и высвобождение штрих-кодов. мРНК подвергаются обратной транскрипции в молекулы кДНК со штрих-кодами 10× и UMI, которые в дальнейшем подлежат созданию стандартной библиотеки секвенирования.
Функции
● Приготовление одноядерной суспензии из замороженных тканей.
● Формирование гелевых шариков в эмульсии (GEM) с последующим синтезом кДНК.
● Каждая бусина в GEM наполнена праймерами, состоящими из 4 секций:
поли(дТ) хвост для прайминга мРНК и синтеза кДНК,
Уникальный молекулярный идентификатор (UMI) для коррекции систематической ошибки амплификации.
10x штрих-код
Последовательность связывания праймера секвенирования частичного чтения 1
Преимущества
Секвенирование одноядерной РНК обходит ограничения секвенирования одноклеточной РНК, позволяя:
● Использование замороженных образцов, а не только свежих образцов.
● Низкий стресс замороженных клеток по сравнению с ферментативной обработкой свежих клеток, что отражается в данных транскриптома в виде меньшего количества генов, индуцируемых стрессом.
● Нет необходимости в предварительном удалении эритроцитов.
● Неограниченный диаметр ячейки.
● Большой набор образцов, подходящих для анализа, включая сложные и хрупкие типы тканей, склонные к скоплению или разрушению клеток во время диссоциации тканей.
Образцы, которые не могут быть проанализированы методом секвенирования одноклеточной РНК и подходят для секвенирования одноядерной РНК:
| Клетка/Ткань | Причина |
| Несвежая замороженная ткань | Невозможно получить свежие или давно сохраненные организации |
| Мышечная клетка, мегакариоцит, жировая… | Диаметр ячейки слишком велик для входа в инструмент. |
| Печень… | Слишком хрупкий, чтобы сломаться, неспособен различить отдельные клетки. |
| Нейронная клетка, Мозг… | Более чувствителен, легко подвержен стрессу, изменит результаты секвенирования. |
| Поджелудочная железа, щитовидная железа… | Богат эндогенными ферментами, влияющими на выработку суспензии отдельных клеток. |
Одноядерное против одноклеточного
| Одноядерный | Одноклеточный |
| Неограниченный диаметр ячейки | Диаметр клеток: 10-40 мкм. |
| Материалом может быть замороженная ткань. | Материал должен быть свежей тканью. |
| Низкий стресс замороженных клеток | Лечение ферментами может вызвать реакцию клеточного стресса |
| Никакие эритроциты не нужно удалять | Эритроциты необходимо удалить |
| Ядерное выражение выражает биоинформацию | Вся клетка выражает биоинформацию |
Технические характеристики
| Образцы требований | Библиотека | Стратегия секвенирования | Рекомендуемые данные | Контроль качества |
| Животные ткани ≥ 200 мг Растительная ткань ≥ 400 мг | 10 библиотек кДНК Genomics sn | Иллюмина PE150 | 100 тыс. операций чтения PE на ячейку (100-200 Гб) | 700-1200 ядер/мкл и целостность ядер, наблюдаемая под микроскопом |
Для получения более подробной информации о руководстве по подготовке проб и рабочем процессе обслуживания, пожалуйста, свяжитесь сэксперт БМКГЕНЕ
Рабочий процесс обслуживания
Включает в себя следующий анализ:
● Контроль качества: количество клеток, обнаружение генов, точная идентификация клеток, молекул РНК и количественная оценка экспрессии.
● Внутренний анализ проб:
Кластеризация ячеек и аннотация кластера
Анализ дифференциальной экспрессии: идентификация ДЭГ в кластерах
Функциональная аннотация и обогащение кластерных DEG
● Межгрупповой анализ:
Комбинация данных
Анализ дифференциальной экспрессии: идентификация ДЭГ в группах
Функциональная аннотация и обогащение групповых ДЭГ
● Расширенный анализ:
Анализ клеточного цикла
Псевдовременной анализ
Анализ сотовой связи (CellPhoneDB)
Анализ обогащения набора генов (GSEA)
Внутренний анализ пробы
Кластеризация ячеек:
Дифференциальный экспрессионный анализ: кластерные DEG
Межгрупповой анализ
Анализ дифференциальной экспрессии: групповые DEG
Расширенный анализ:
Псевдовременной анализ:
Анализ клеточного цикла:
Изучите достижения, достигнутые благодаря услугам BMKGene по секвенированию одноядерной РНК с помощью 10X Chromium, в этих избранных публикациях:
Ван, Л. и др. (2021) «Одноклеточный транскриптомный анализ выявляет иммунный ландшафт легких при обострении стероидорезистентной астмы»,Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки., 118(2), с. е2005590118. дои: 10.1073/pnas.2005590118
Чжэн, Х. и др. (2022) «Глобальная регуляторная сеть нарушения регуляции экспрессии генов и аномальной метаболической передачи сигналов в иммунных клетках в микроокружении болезни Грейвса и тиреоидита Хашимото»,Границы в иммунологии, 13, с. 879824. doi: 10.3389/FIMMU.2022.879824/BIBTEX.
Тиан, Х. и др. (2023) «Одноклеточный транскриптом выявляет гетерогенность и иммунные реакции лейкоцитов после вакцинации инактивированной Edwardsiella tarda у камбалы (Paralichthys olivaceus)»,Аквакультура, 566, с. 739238. doi: 10.1016/J.AQUACULTURE.2023.739238.
Ю, Ю. и др. (2023) «Фотодинамическая терапия улучшает результаты применения ингибиторов иммунных контрольных точек за счет ремоделирования противоопухолевого иммунитета у пациентов с раком желудка»,Рак желудка, 26(5), стр. 798–813. doi: 10.1007/S10120-023-01409-X/METRICS.
