Transcriptomică
natură
Comunicări
Caracterizarea transcrierii complete a mutației SF3B1 în leucemia limfocitară cronică dezvăluie reglarea în jos a intronilor reținuți
Transcripții cu lungime completă | Secvențiere nanopore | Analiza alternativă a izoformei
Fundal
SMutațiile omologice ale factorului de splicing SF3B1 au fost raportate pe scară largă pentru a se asocia cu diverse tipuri de cancer, inclusiv leucemia limfocitară cronică (CLL), melanomul uveal, cancerul de sân, etc. În plus, studiile transcriptomice cu citire scurtă au relevat modele de splicing aberant induse de mutațiile SF3B1. Cu toate acestea, studiile asupra acestor modele alternative de splicing s-au limitat de mult timp la nivelul evenimentului și la lipsa de cunoștințe la nivelul izoformei din cauza limitării transcrierilor asamblate cu citire scurtă. Aici, platforma de secvențiere a nanopore a fost introdusă pentru a genera transcrieri de lungime completă, ceea ce a împuternicit inverstigarea asupra izoformelor.
Proiectare experimentală
Experimente
Grupare:1. CLL-SF3B1 (WT) 2. CLL-SF3B1 (mutație K700E); 3. Celulele B normale
Strategie de secvențiere:Secvențiere de bibliotecă Minion 2D, secvențiere a bibliotecii Promethion 1D; Date de citire scurtă din aceleași probe
Platforma de secvențiere:Ont Minion; Ont Promethion;
Analiza bioinformatică
Rezultate
OTotal de 257 de milioane de citiri au fost generate din 6 probe CLL și 3 celule B. În medie, 30,5% din aceste lecturi au fost identificate ca transcrieri de lungime completă.
FAnaliza izoformelor alternative de lungime ULL a ARN (FLAIR) a fost dezvoltată pentru a genera un set de izoforme de înaltă încredere. Flair poate fi rezumat ca:
NAnopore citește alinierea: identificarea structurii de transcriere generală bazată pe genomul de referință;
SCorecția de joncțiune Plice: erori de secvență corecte (roșu) cu site-ul Splice din introni adnotați, introni din datele de citire scurtă sau ambele;
COllapse: rezumați izoformele reprezentative bazate pe lanțuri de joncțiune splice (set de prim-trecere). Selectați izofrom de înaltă încredere pe baza numărului de lecturi de susținere (prag: 3).
Figura.
FLair a identificat 326.699 izoforme împletite de încredere înaltă, dintre care 90% sunt noi izoforme. Majoritatea acestor izoforme neanotate s -au dovedit a fi noi combinații de jetoane de splice cunoscute (142.971), în timp ce restul de izoforme noi conțineau fie un intron reținut (21.700), fie un nou exon (3594).
LSecvențe de citire ONG împuternicește identificarea site-urilor de splice modificate mutant SF3B1-K700E la nivel de izoform. S-a constatat că 35 alternative 3'SS și 10 alternative 5'SS-uri alternative sunt semnificativ diferențiate între SF3B1-K700E și SF3B1-WT. 33 din cele 35 de modificări au fost recent descoperite prin secvențe de citire lungă. În datele nanopore, distribuția distanței între 3'sss la SF3B1-K700E-modificat 3'SSS la Sites Canonical Peaks este în jur de -20 bp, ceea ce este semnificativ diferit de o distribuție de control, similar cu ceea ce a fost raportat în secvențele CLL. Au fost analizate izoformele genei ergic3, unde o nouă izoformă care conține situsul splice proximal au fost găsite mai abundente în SF3B1-K700E. Atât 3'S -urile proximale, cât și cele distale au fost asociate cu distincții ca tipare care generează mai multe izoforme.
Figura 2. Modele alternative de splicing 3 ′ identificate cu date de secvențiere a nanoporelor
Analiza de utilizare a evenimentelor IR a fost limitată de mult timp în analiza bazată pe citire scurtă din cauza încrederii în identificarea și cuantificarea IR. Expresia izoformelor IR în SF3B1-K700E și SF3B1-WT au fost cuantificate pe baza secvențelor nanopore, dezvăluind o reglare globală în jos a izoformelor IR în SF3B1-K700E.
Figura 4. Intensitatea agriculturii și conectivitatea rețelei pe trei sisteme agricole (A și B); Analiza aleatorie a pădurilor (C) și relația dintre intensitatea agricolă și colonizarea AMF (D)
Figura 3. Evenimentele de închiriere a intronilor sunt mai puternic reglementate în CLL SF3B1-K700E
Tehnologie
Secvențiere de citire lungă nanopore
NSecvențializarea anopore este o singură tehnologie de secvențiere a semnalului electric în timp real.
DADN-ul sau ARN-ul cu orientare se vor lega de proteina nanoporoasă încorporată în biofilm și de relaxare sub plumbul proteinei motorii.
DȘuvițele Na/ARN trec prin proteina canalului nanopore la un anumit ritm sub acțiunea diferenței de tensiune.
MOleculele generează semnale electrice diferite în funcție de structura chimică.
RDetectarea timpului Eal a secvențelor se realizează prin apeluri de bază.
Performanța secvențierii transcriptomului de lungime completă
√ Saturația datelor
De 7 ori mai puține citiri necesare pentru a ajunge la saturație comparabilă a datelor.
√ Identificarea structurii transcrierii
Identificarea diverselor variante structurale cu un consens de citire completă a fiecărei transcrieri
√ Analiza diferențială la nivel de transcript-Modificări de dezvăluire ascunse prin citiri scurte
Referinţă
Tang AD, Soulette CM, Baren MJV și colab. Caracterizarea transcrierii complete a mutației SF3B1 în leucemia limfocitară cronică dezvăluie reglarea în jos a intronilor reținuți [J]. Comunicări naturale.
Tehnologie și evidențieri Având în vedere împărtășirea celei mai recente aplicări de succes a diferitelor tehnologii de secvențiere cu un randament ridicat în diferite arene de recuperare, precum și idei strălucitoare în proiectarea experimentală și exploatarea datelor.
Timpul post: 08-2022 ianuarie