RESEQUENȚĂ DE GENOMĂ
Monitorizarea genomică a SARS-CoV-2 descoperă o variantă de ștergere a NSP1 care modulează răspunsul interferonului de tip I
Nanopore | Illumina | RESECHISIE DE GENOMĂ ÎNTREPRINDERE | Metagenomică | ARN-seq | Sanger
Biomarker Technologies a oferit asistență tehnică pentru secvențarea eșantionului în acest studiu.
Repere
1.SARS-CoV-2 Secvențarea genomului și analiza filognetică identifică 35 de mutații recurente, inclusiv 31 SNP și 4 indeluri.
2. Asocierea cu 117 fenotipuri clinice dezvăluie potențial
mutații importante.
∆500-532 În regiunea de codare NSP1 se corelează cu viral mai mic
3. Încărcați și IFN-β ser.
4. Izolatele virale cu mutație ∆500-532 induc IFN-I mai scăzut
Răspuns în celulele infectate.
Proiectare experimentală
Realizări
1. Covid-19 supraveghere epidemiologică și genomică
Datele clinice au fost colectate în provincia Sichuan, China în toată perioada de focar, în perioada 22 ianuarie 2020-20 februarie 2020. Un total de 538 de cazuri COVID-19 au fost confirmate de testele qPCR la Sichuan, 28,8% dintre acestea fiind din provincie din provincie capital. Cazurile confirmate în Sichuan au crescut exponențial, atingând maxim pe 30 ianuarie. De asemenea, datele au susținut că distanța socială poate fi un factor cheie în prevenirea răspândirii virusului.
Figura 1. Studiul epidemiologic al Covid-19 în provincia Sichuan, China
2. Sars-Cov-2 Construcția genomului și identificarea variantelor
Cu amplificarea PCR multiplex urmată de secvențarea nanoporelor, au fost generați un total de 310 genomi aproape sau parțiali compleți de la 248 de pacienți cu aprox. 80% din genomii acoperiți de 10 citiri (adâncimea medie: 0,39 m citiri pe eșantion).
Figura 2. Frecvența fiecărei variante în cohorta Sichuan
Un total de 104 SNP și 18 indeluri au fost identificate din genomii SARS-CoV-2, în care au fost identificate 31 de SNP și 4 indeluri ca variante genetice recurente. Prin compararea lor cu 169 de probe de la Wuhan și cu 81.391 secvențe de genom public de înaltă calitate în GISAID, 29 din cele 35 de variante găsite prezentate pe alte continente. În special, patru variante, inclusiv ∆500-532, ACC18108AT, ∆729-737 și T13243C, au fost găsite doar în Sichuan și Wuhan și absente în datele GISAID, ceea ce indică faptul că aceste variante au fost foarte susceptibile de Înregistrări de călătorie ale pacienților.
Analiza evolutivă cu metoda de probabilitate maximă (ML) și abordările ceasului molecular bayesian a fost procesată pe 88 de noi virus Sfrom Sichuan și 250 de genomuri curate din alte regiuni. Genomii cu ∆500-532 (ștergeri în regiunea de codare NSP1) au fost găsite distribuite puțin în arborele filogenetic. Analiza haplotipului pe variantele NSP1 a identificat 5 dintre ele din mai multe orașe. Aceste rezultate au sugerat că ∆500-532 au avut loc în mai multe orașe și ar putea fi importate de mai multe ori de la Wuhan.
Figura 2. Variante genetice recurente și analiză filogenetică în genomii SARS-CoV-2
3. Asocierea variantelor genetice recurente cu implicații clinice
117 fenotipuri clinice au fost asociate cu severitatea Covid-19, unde 19 fenotipuri legate de severitate au fost clasificate în trăsături severe și non-severe. Relația dintre aceste trăsături și 35 de variante genetice recurente au fost viualizate în map de căldură bi-cluster. O analiză de îmbogățire clasată asemănătoare cu GSEA a arătat că ∆500-532 este corelat negativ cu ESR, IFN-β și CD8+ CD8+ contează în sânge. Mai mult, testele qPCR au arătat că pacienții infectați cu virus care adăpostesc ∆500-532 au avut cea mai mare valoare CT, adică cea mai mică sarcină virală.
Figura 3. Asocieri de 35 de variante genetice recurente cu fenotipuri clinice
4. Validarea pe fenotipurile clinice asociate mutației virale asociate
Pentru a înțelege efectele ∆500-532 asupra funcțiilor NSP1, celulele HEK239T au fost transfectate cu plasmide care exprimă forme de lungime completă, WT NSP1 și mutante cu ștergeri. Profilurile transcriptome ale fiecărei celule HEK239T tratate au fost procesate pentru analiza PCA, arătând că mutanții de ștergere s -au grupat relativ mai aproape și au fost semnificativ diferiți de WT NSP1. Genele care au fost reglementate semnificativ la mutanți s -au îmbogățit în principal în „procesul biosintetic/metabolic peptidic”, „biogeneză complexă de ribonucleoproteină”, „care vizează proteine către membrană/ER”, etc. Mai mult, două ștergeri au arătat un model distinct de expsie de la WT.
Figura 4. Analiza transcriptomului pe celulele HEK239T transfectate de WT NSP1 și cea cu ștergeri
Efectele ștergerilor pe răspunsul IFN-1 au fost, de asemenea, testate în studiul supraexprimat. S-a arătat că toate ștergerile testate reduc IFN-1 Repsonse în celulele transfectate HEK239T și A549 atât la nivel de transcriptom, cât și la nivel de proteine. Interesant este că genele reglementate semnificativ în ștergeri s-au îmbogățit în „răspunsul apărării la virus”, „replicarea genomului viral”, „reglarea transcrierii prin ARN polimeraza II” și „Răspuns la interferonul de tip I”.
Figura 5. Reglarea în jos a căilor de semnalizare a interferonului în mutant ∆500-532
În acest studiu, impactul acestor ștergeri asupra virusului a fost confirmat în continuare de studiile de infecție virală. Virusurile cu anumiți mutanți au fost izolați din eșantioane clinice și infectate în celulele CALU-3. Rezultate detaliate privind studiul infecției virale pot fi citite în lucrare.
DOI:10.1016/j.chom.2021.01.015
Referinţă
Lin J, Tang C, Wei H, și colab. Monitorizarea genomică a SARS-CoV-2 descoperă o variantă de ștergere NSP1 care modulează răspunsul interferonului de tip I [J]. Cell Host & Microbe, 2021.
Știri și evidențieri Are ca scop împărtășirea celor mai recente cazuri de succes cu Biomarker Technologies, surprinzând noi realizări științifice, precum și tehnici proeminente aplicate în timpul studiului.
Timpul post: 06-2022 ianuarie