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Sequenciamento de RNA de núcleos únicos

O desenvolvimento de técnicas de captura de célula única e personaliza, juntamente com o sequenciamento de alto rendimento, revolucionou os estudos de expressão gênica no nível celular. Esse avanço permite uma análise mais profunda e abrangente de populações celulares complexas, superando as limitações associadas à média da expressão gênica sobre todas as células e preservando a verdadeira heterogeneidade dentro dessas populações. Enquanto o sequenciamento de RNA de célula única (SCRNA-seq) tem vantagens inegáveis, ele encontra desafios em certos tecidos em que a criação de uma suspensão única de célula se mostra difícil e requer amostras novas. Na BMKGENE, abordamos esse obstáculo ao oferecer sequenciamento de RNA de núcle único (snRNA-seq) usando a tecnologia de cromo genômica 10x de última geração. Essa abordagem amplia o espectro das amostras passíveis de análise de transcriptoma no nível de célula única.

O isolamento dos núcleos é realizado através do inovador chip de cromo genômica 10x, apresentando um sistema de microfluídicos de oito canais com cruzamentos duplos. Dentro desse sistema, as contas de gel que incorporam códigos de barras, iniciadores, enzimas e um núcleo único são encapsulados em quedas de óleo do tamanho de nanoliter, formando contas de gel em emulsão (GEM). Após a formação de gem, a lise celular e a liberação do código de barras ocorrem dentro de cada gem. Posteriormente, as moléculas de mRNA sofrem transcrição reversa em cDNAs, incorporando códigos de barras 10x e identificadores moleculares únicos (UMIs). Esses cDNAs são então submetidos à construção de bibliotecas de sequenciamento padrão, facilitando uma exploração robusta e abrangente dos perfis de expressão gênica no nível de célula única.

Plataforma: 10 × Genomics Chromium e Illumina Novaseq Platform

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Detalhes do serviço

Bioinformática

Resultados da demonstração

Publicações em destaque

Esquema técnico

O isolamento dos núcleos é alcançado por 10 × Genomics Chromium ™, que consiste no sistema de microfluídicos de oito canais com cruzamentos duplos. Nesse sistema, um gel de gel com códigos de barras e primer, enzimas e um único núcleo são encapsulados na queda de óleo do tamanho de nanoliter, gerando contas de gel em emulsão (gem). Uma vez formado a gem, a lise celular e a liberação de códigos de barras são realizados em cada gem. O mRNA é transcrito reverso em moléculas de cDNA com códigos de barras 10 × e UMI, que estão mais sujeitos à construção de bibliotecas de sequenciamento padrão.

Características

● Preparação da suspensão de nuclei de tecidos congelados

● Formação de Gel Bead-Emulsão (GEM) seguida de síntese de cDNA

● Cada cordão em uma jóia é carregado com iniciadores compostos por 4 seções:

Tail de poli (dt) para priming de mRNA e síntese de cDNA,

Identificador molecular exclusivo (UMI) para corrigir o viés de amplificação

10x código de barras

Sequência de ligação de leitura parcial 1 Primer de seqüenciamento

Vantagens

O sequenciamento de RNA único-nucleus circunha as limitações do sequenciamento de RNA de célula única, permitindo:

● O uso de amostras congeladas e não apenas limitada a amostras novas

● Baixo estresse das células congeladas quando comparado ao tratamento enzimático de células frescas, refletidas nos dados do transcriptoma na forma de menos genes induzidos por estresse

● Não há necessidade de remoção prévia de glóbulos vermelhos

● diâmetro celular ilimitado

● Grande variedade de amostras que são elegíveis para análise, incluindo tipos de tecido complexos e frágeis que são propensos a aglomerados ou destruição de células durante a dissociação do tecido

Amostras que não podem ser analisadas pelo seqüenciamento de RNA de célula única e são elegíveis para o seqüenciamento de RNA de núcleos únicos:

Célula / tecido	Razão
Tecido congelado sem preenchimento	Incapaz de obter organizações novas ou de longo prazo
Célula muscular, megakariócitos, gordura…	O diâmetro da célula é muito grande para entrar no instrumento
Fígado…	Muito frágil para quebrar, incapaz de distinguir células únicas
Célula de neurônios, cérebro…	Mais sensível, fácil de estressar, mudará os resultados de seqüenciamento
Pâncreas, tireóide…	Rico em enzimas endógenas, afetando a produção de suspensão de célula única

Nucleo único vs célula única

Núcleo único	Célula única
Diâmetro celular ilimitado	Diâmetro celular: 10-40 μm
O material pode ser congelado	O material deve ser tecido fresco
Baixo estresse de células congeladas	O tratamento enzimático pode causar reação de estresse celular
Nenhum glóbulo vermelho precisa ser removido	Os glóbulos vermelhos precisam ser removidos
A nuclear expressa bioinformação	Toda a célula expressa bioinformação

Especificações

Requisitos de amostra

Biblioteca

Estratégia de sequenciamento

Dados recomendados

Controle de qualidade

Tecido animal ≥ 200 mg

Tecido vegetal ≥ 400 mg

Biblioteca de cDNA da genômica 10x

Illumina PE150

100k PE lê por célula

(100-200 GB)

700-1200 núcleos/μl e integridade de núcleos observados sob microscópio

Para mais detalhes sobre a orientação de preparação de amostras e fluxo de trabalho de serviço, sinta -se à vontade para conversar com umEspecialista em BMKGENE

Fluxo de trabalho de serviço

Anterior: Sequenciamento de genoma inteiro de plantas/animais

Próximo: Análise de associação em todo o genoma

Inclui a seguinte análise:

● Controle de qualidade: número de células, detecção de genes, identificação precisa das células, moléculas de RNA e quantificação de expressão

● Análise de amostra interna:

Agrupamento de células e anotação de cluster

Análise de expressão diferencial: identificação de degs em clusters

Anotação funcional e enriquecimento de degs de cluster

● Análise entre grupos:

Combinação de dados

Análise de expressão diferencial: identificação de DEGs em grupos

Anotação funcional e enriquecimento de Grupo Degs

● Análise avançada:

Análise do ciclo celular

Análise de pseudotime

Análise de comunicação celular (CellphonedB)

Análise de enriquecimento do conjunto de genes (GSEA)

Análise de amostra interna

Cluster de células:

Análise de expressão diferencial: degs de cluster

Análise entre grupos

Análise de expressão diferencial: Grupo Degs

Análise Avançada:

Análise de pseudotime:

Análise do ciclo celular:

Explore os avanços facilitados pelos Serviços de Sequenciamento de RNA de Nucleus único da BMKGENE por 10x Chromium nessas publicações em destaque:

Wang, L. et al. (2021) 'Análise transcriptômica de célula única revela o cenário imunológico do pulmão na exacerbação da asma resistente a esteróides',Anais da Academia Nacional de Ciências dos Estados Unidos da América, 118 (2), p. E2005590118. doi: 10.1073/pnas.2005590118

Zheng, H. et al. (2022) 'Uma rede regulatória global para expressão gênica desregulada e sinalização metabólica anormal em células imunes no microambiente da doença de Graves e na tireoidite de Hashimoto',Fronteiras em imunologia, 13, p. 879824. DOI: 10.3389/FIMMU.2022.879824/BIBTEX.

Tian, H. et al. (2023) 'O transcriptoma de célula única descobre a heterogeneidade e as respostas imunes dos leucócitos após a vacinação com Edwardsiella Tarda inativada em linguado (Paralichthys olivaceus)',Aquicultura, 566, p. 739238. Doi: 10.1016/j.aquaculture.2023.739238.

Yu, Y. et al. (2023) 'A terapia fotodinâmica melhora o resultado de inibidores do ponto de verificação imune por meio da remodelação da imunidade antitumoral em pacientes com câncer gástrico',Câncer gástrico, 26 (5), pp. 798–813. doi: 10.1007/s10120-023-01409-x/métricas.