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Sequenciamento de RNA de núcleo único
O desenvolvimento de técnicas de captura unicelular e construção de bibliotecas personalizadas, juntamente com sequenciamento de alto rendimento, revolucionou os estudos de expressão gênica em nível celular. Este avanço permite uma análise mais profunda e abrangente de populações celulares complexas, superando as limitações associadas à média da expressão gênica em todas as células e preservando a verdadeira heterogeneidade dentro dessas populações. Embora o sequenciamento de RNA unicelular (scRNA-seq) tenha vantagens inegáveis, ele encontra desafios em certos tecidos onde a criação de uma suspensão unicelular se mostra difícil e requer amostras frescas. Na BMKGene, enfrentamos esse obstáculo oferecendo sequenciamento de RNA de núcleo único (snRNA-seq) usando a tecnologia de ponta 10X Genomics Chromium. Esta abordagem amplia o espectro de amostras passíveis de análise do transcriptoma no nível unicelular.
O isolamento dos núcleos é realizado através do inovador chip 10X Genomics Chromium, apresentando um sistema microfluídico de oito canais com cruzamentos duplos. Dentro deste sistema, esferas de gel incorporando códigos de barras, primers, enzimas e um único núcleo são encapsuladas em gotas de óleo do tamanho de nanolitros, formando Gel Bead-in-Emulsion (GEM). Após a formação do GEM, a lise celular e a liberação do código de barras ocorrem dentro de cada GEM. Posteriormente, as moléculas de mRNA passam por transcrição reversa em cDNAs, incorporando códigos de barras 10X e identificadores moleculares únicos (UMIs). Esses cDNAs são então submetidos à construção de uma biblioteca de sequenciamento padrão, facilitando uma exploração robusta e abrangente de perfis de expressão gênica no nível unicelular.
Plataforma: 10× Genomics Chromium e plataforma Illumina NovaSeq
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10x Transcriptoma Espacial Visium Genomics
A transcriptômica espacial é uma tecnologia de ponta que permite aos pesquisadores investigar padrões de expressão gênica dentro dos tecidos, preservando seu contexto espacial. Uma plataforma poderosa neste domínio é o 10x Genomics Visium acoplado ao sequenciamento Illumina. O princípio do 10X Visium reside em um chip especializado com uma área de captura designada onde as seções de tecido são colocadas. Esta área de captura contém pontos com código de barras, cada um correspondendo a uma localização espacial única dentro do tecido. As moléculas de RNA capturadas do tecido são então rotuladas com identificadores moleculares únicos (UMIs) durante o processo de transcrição reversa. Esses pontos com código de barras e UMIs permitem mapeamento espacial preciso e quantificação da expressão gênica em resolução unicelular. A combinação de amostras com códigos de barras espaciais e UMIs garante a precisão e especificidade dos dados gerados. Ao usar esta tecnologia de Transcriptômica Espacial, os pesquisadores podem obter uma compreensão mais profunda da organização espacial das células e das complexas interações moleculares que ocorrem dentro dos tecidos, oferecendo informações valiosas sobre os mecanismos subjacentes aos processos biológicos em vários campos, incluindo oncologia, neurociência, biologia do desenvolvimento, imunologia. e estudos botânicos.
Plataforma: 10X Genomics Visium e Illumina NovaSeq
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Sequenciamento completo de mRNA-Nanopore
Embora o sequenciamento de mRNA baseado em NGS seja uma ferramenta versátil para quantificar a expressão gênica, sua dependência de leituras curtas restringe sua eficácia em análises transcriptômicas complexas. Por outro lado, o sequenciamento de nanoporos emprega tecnologia de leitura longa, permitindo o sequenciamento de transcritos de mRNA completos. Esta abordagem facilita uma exploração abrangente de splicing alternativo, fusões genéticas, poliadenilação e quantificação de isoformas de mRNA.
O sequenciamento de nanoporos, um método que se baseia em sinais elétricos de molécula única de nanoporos em tempo real, fornece resultados em tempo real. Guiado por proteínas motoras, o DNA de fita dupla liga-se a proteínas de nanoporos incorporadas em um biofilme, desenrolando-se à medida que passa pelo canal de nanoporos sob uma diferença de voltagem. Os sinais elétricos distintos gerados por diferentes bases na cadeia de DNA são detectados e classificados em tempo real, facilitando o sequenciamento preciso e contínuo de nucleotídeos. Esta abordagem inovadora supera as limitações de leitura curta e fornece uma plataforma dinâmica para análises genômicas complexas, incluindo estudos transcriptômicos complexos, com resultados imediatos.
Plataforma: Nanopore PromethION 48
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Sequenciamento completo de mRNA -PacBio
Embora o sequenciamento de mRNA baseado em NGS seja uma ferramenta versátil para quantificar a expressão gênica, sua dependência de leituras curtas restringe seu uso em análises transcriptômicas complexas. Por outro lado, o sequenciamento PacBio (Iso-Seq) emprega tecnologia de leitura longa, permitindo o sequenciamento de transcrições completas de mRNA. Esta abordagem facilita uma exploração abrangente de splicing alternativo, fusões de genes e poliadenilação. No entanto, existem outras opções para quantificação da expressão gênica devido à grande quantidade de dados necessários. A tecnologia de sequenciamento PacBio depende do sequenciamento de molécula única em tempo real (SMRT), proporcionando uma vantagem distinta na captura de transcritos de mRNA completos. Esta abordagem inovadora envolve o uso de guias de ondas de modo zero (ZMWs) e poços microfabricados que permitem a observação em tempo real da atividade da DNA polimerase durante o sequenciamento. Dentro desses ZMWs, a DNA polimerase da PacBio sintetiza uma fita complementar de DNA, gerando leituras longas que abrangem a totalidade das transcrições de mRNA. A operação do PacBio no modo de sequenciamento de consenso circular (CCS) aumenta a precisão ao sequenciar repetidamente a mesma molécula. As leituras HiFi geradas têm uma precisão comparável à do NGS, contribuindo ainda mais para uma análise abrangente e confiável de características transcriptômicas complexas.
Plataforma: PacBio Sequel II; PacBio Revisão
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Sequenciamento de mRNA eucariótico-NGS
O sequenciamento de mRNA, uma tecnologia versátil, permite o perfil abrangente de todas as transcrições de mRNA dentro das células sob condições específicas. Com suas amplas aplicações, esta ferramenta de ponta revela intrincados perfis de expressão gênica, estruturas genéticas e mecanismos moleculares associados a diversos processos biológicos. Amplamente adotado em pesquisas fundamentais, diagnósticos clínicos e desenvolvimento de medicamentos, o sequenciamento de mRNA oferece insights sobre os meandros da dinâmica celular e da regulação genética, despertando a curiosidade sobre seu potencial em vários campos.
Plataforma: Illumina NovaSeq X; DNBSEQ-T7
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Sequenciamento de mRNA baseado em não referência-NGS
O sequenciamento de mRNA permite o perfil abrangente de todas as transcrições de mRNA dentro das células sob condições específicas. Esta tecnologia de ponta serve como uma ferramenta potente, revelando intrincados perfis de expressão genética, estruturas genéticas e mecanismos moleculares associados a diversos processos biológicos. Amplamente adotado em pesquisas fundamentais, diagnósticos clínicos e desenvolvimento de medicamentos, o sequenciamento de mRNA oferece insights sobre as complexidades da dinâmica celular e da regulação genética.
Plataforma: Illumina NovaSeq X; DNBSEQ-T7
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Sequenciamento longo sem codificação-Illumina
RNAs não codificantes longos (lncRNAs) têm mais de 200 nucleotídeos que possuem potencial de codificação mínimo e são elementos essenciais dentro do RNA não codificante. Encontrados no núcleo e no citoplasma, esses RNAs desempenham papéis cruciais na regulação epigenética, transcricional e pós-transcricional, ressaltando sua importância na formação de processos celulares e moleculares. O sequenciamento de LncRNA é uma ferramenta poderosa na diferenciação celular, ontogênese e doenças humanas.
Plataforma: Illumina NovaSeq
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Sequenciamento de RNA pequeno-Illumina
Moléculas pequenas de RNA (sRNA), incluem microRNAs (miRNAs), pequenos RNAs interferentes (siRNAs) e RNAs que interagem com piwi (piRNAs). Entre estes, os miRNAs, com cerca de 18-25 nucleotídeos de comprimento, são particularmente notáveis por seus papéis reguladores essenciais em vários processos celulares. Com padrões de expressão específicos de tecido e de estágio, os miRNAs exibem alta conservação em diferentes espécies.
Plataforma: Illumina NovaSeq
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Sequenciamento CircRNA-Illumina
O sequenciamento circular de RNA (circRNA-seq) visa traçar e analisar RNAs circulares, uma classe de moléculas de RNA que formam circuitos fechados devido a eventos de splicing não canônicos, proporcionando a esse RNA maior estabilidade. Embora tenha sido demonstrado que alguns circRNAs atuam como esponjas de microRNA, sequestrando microRNAs e impedindo-os de regular seus mRNAs alvo, outros circRNAs podem interagir com proteínas, modular a expressão gênica ou ter funções em processos celulares. A análise da expressão do circRNA fornece insights sobre os papéis reguladores dessas moléculas e seu significado em vários processos celulares, estágios de desenvolvimento e condições de doença, contribuindo para uma compreensão mais profunda da complexidade da regulação do RNA no contexto da expressão gênica.
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Sequenciamento do transcriptoma completo – Illumina
O sequenciamento completo do transcriptoma oferece uma abordagem abrangente para traçar o perfil de diversas moléculas de RNA, abrangendo RNAs codificantes (mRNA) e não codificadores (lncRNA, circRNA e miRNA). Esta técnica captura todo o transcriptoma de células específicas num determinado momento, permitindo uma compreensão holística dos processos celulares. Também conhecido como “sequenciamento total de RNA”, visa desvendar redes regulatórias intrincadas no nível do transcriptoma, permitindo análises aprofundadas, como RNA endógeno concorrente (ceRNA) e análise conjunta de RNA. Isto marca o passo inicial para a caracterização funcional, particularmente no desvendamento das redes reguladoras que envolvem interações de ceRNA baseadas em circRNA-miRNA-mRNA.
