Sekwencjonowanie pojedynczego jądra RNA
Schemat techniczny
Izolację jąder uzyskuje się za pomocą 10× Genomics Chromium™, który składa się z ośmiokanałowego układu mikroprzepływowego z podwójnym przejściem. W tym systemie kulki żelowe z kodami kreskowymi i podkładem, enzymami i pojedynczym jądrem są zamknięte w kropli oleju o wielkości nanolitra, tworząc żelową kulkę w emulsji (GEM). Po utworzeniu GEM w każdym GEM przeprowadzana jest liza komórek i uwalnianie kodów kreskowych. mRNA poddaje się odwrotnej transkrypcji na cząsteczki cDNA z 10-krotnymi kodami kreskowymi i UMI, które są następnie poddawane standardowej konstrukcji biblioteki sekwencjonowania.
Cechy
● Przygotowanie zawiesiny jednojądrowej z zamrożonych tkanek
● Tworzenie kulek żelowych w emulsji (GEM), a następnie synteza cDNA
● Każdy koralik w GEM jest obciążony starterami składającymi się z 4 sekcji:
ogon poli(dT) do starterów mRNA i syntezy cDNA,
Unikalny identyfikator molekularny (UMI) korygujący błąd wzmocnienia
10x kod kreskowy
Sekwencja wiązania startera sekwencjonującego częściowy odczyt 1
Zalety
Sekwencjonowanie RNA jednojądrowego omija ograniczenia sekwencjonowania RNA jednokomórkowego, umożliwiając:
● Stosowanie próbek zamrożonych i nie ogranicza się tylko do próbek świeżych
● Niski stres zamrożonych komórek w porównaniu z obróbką enzymatyczną świeżych komórek, odzwierciedlony w danych transkryptomu w postaci genów mniej indukowanych stresem
● Nie ma potrzeby wcześniejszego usuwania czerwonych krwinek
● Nieograniczona średnica ogniwa
● Duży wybór próbek kwalifikujących się do analizy, w tym złożone i delikatne typy tkanek, które są podatne na zlepianie się lub niszczenie komórek podczas dysocjacji tkanek
Próbki, których nie można poddać analizie metodą sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek i które kwalifikują się do sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra:
| Komórka/Tkanka | Powód |
| Nieświeża zamrożona tkanka | Nie można uzyskać nowych lub długo zapisanych organizacji |
| Komórka mięśniowa, megakariocyt, tłuszcz… | Średnica kuwety jest zbyt duża, aby wejść do instrumentu |
| Wątroba… | Zbyt kruche, aby je rozbić, niezdolne do rozróżnienia pojedynczych komórek |
| Komórka neuronowa, mózg… | Bardziej wrażliwy, łatwy do zestresowania, zmieni wyniki sekwencjonowania |
| Trzustka, tarczyca… | Bogaty w enzymy endogenne, wpływające na wytwarzanie zawiesiny pojedynczych komórek |
Pojedyncze jądro vs pojedyncza komórka
| Jednojądrowe | Jednokomórkowy |
| Nieograniczona średnica ogniwa | Średnica komórki: 10-40 µm |
| Materiałem może być zamrożona tkanka | Materiał musi być świeżą chusteczką |
| Niski stres zamrożonych komórek | Traktowanie enzymami może powodować reakcję stresową komórkową |
| Nie ma potrzeby usuwania czerwonych krwinek | Należy usunąć czerwone krwinki |
| Jądrowy wyraża bioinformację | Cała komórka wyraża bioinformację |
Dane techniczne
| Przykładowe wymagania | Biblioteka | Strategia sekwencjonowania | Zalecane dane | Kontrola jakości |
| Tkanka zwierzęca ≥ 200 mg Tkanka roślinna ≥ 400 mg | 10x biblioteka cDNA Genomics sn | Illumina PE150 | 100 tys. odczytów PE na komórkę (100-200 Gb) | 700-1200 jąder/μl i integralność jąder obserwowana pod mikroskopem |
Aby uzyskać więcej informacji na temat wskazówek dotyczących przygotowania próbek i przebiegu usług, skontaktuj się z: aEkspert BMKGENE
Przebieg prac serwisowych
Zawiera następującą analizę:
● Kontrola jakości: liczba komórek, wykrywanie genów, dokładna identyfikacja komórek, cząsteczek RNA i ilościowe oznaczanie ekspresji
● Analiza próbki wewnętrznej:
Grupowanie komórek i adnotacja klastrów
Analiza wyrażeń różniczkowych: identyfikacja DEG w klastrach
Adnotacja funkcjonalna i wzbogacanie klastrów DEG
● Analiza międzygrupowa:
Połączenie danych
Różnicowa analiza ekspresji: identyfikacja DEG w grupach
Adnotacja funkcjonalna i wzbogacanie grup DEG
● Zaawansowana analiza:
Analiza cyklu komórkowego
Analiza pseudoczasowa
Analiza komunikacji komórkowej (CellPhoneDB)
Analiza wzbogacenia zestawu genów (GSEA)
Analiza próbki wewnętrznej
Grupowanie komórek:
Różnicowa analiza wyrażeń: klastry DEG
Analiza międzygrupowa
Analiza wyrażeń różniczkowych: grupy DEG
Zaawansowana analiza:
Analiza pseudoczasowa:
Analiza cyklu komórkowego:
Zapoznaj się z postępami, jakie umożliwiły usługi sekwencjonowania jednojądrowego RNA BMKGene oferowane przez 10X Chromium, w następujących publikacjach:
Wang, L. i in. (2021) „Analiza transkryptomiczna pojedynczych komórek ujawnia krajobraz immunologiczny płuc w zaostrzeniu astmy steroidoopornej”,Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America, 118 ust. 2, s. 1. e2005590118. doi: 10.1073/pnas.2005590118
Zheng, H. i in. (2022) „Globalna sieć regulacyjna dotycząca rozregulowanej ekspresji genów i nieprawidłowej sygnalizacji metabolicznej w komórkach odpornościowych w mikrośrodowisku choroby Gravesa-Basedowa i zapalenia tarczycy Hashimoto”,Granice w immunologii, 13, s. 879824. doi: 10.3389/FIMMU.2022.879824/BIBTEX.
Tian, H. i in. (2023) „Transkryptom jednokomórkowy odkrywa heterogeniczność i odpowiedź immunologiczną leukocytów po szczepieniu inaktywowaną Edwardsiella tarda u flądry (Paralichthys olivaceus)”,Akwakultura, 566, s. 739238. doi: 10.1016/J.AQUACULTURE.2023.739238.
Yu, Y. i in. (2023) „Terapia fotodynamiczna poprawia działanie inhibitorów punktów kontrolnych układu odpornościowego poprzez przebudowę odporności przeciwnowotworowej u pacjentów z rakiem żołądka”,Rak żołądka, 26(5), s. 798–813. doi: 10.1007/S10120-023-01409-X/METRICS.
