Reseksucja całego genomu
Monitorowanie genomiki SARS-COV-2 odkrywa wariant delecji NSP1, który moduluje odpowiedź interferonu typu I
Nanopore | Illumina | Resekwencjonowanie całego genomu | Metagenomika | RNA-Seq | Sanger
Biomarker Technologies zapewniło wsparcie techniczne w sekwencjonowaniu próbek w tym badaniu.
Przegląd najważniejszych wydarzeń
1. Sekwencjonowanie genomu i analiza genomu SARS-COV-2 identyfikują 35 nawracających mutacji, w tym 31 SNP i 4 indele.
2. Asocjacja 117 fenotypów klinicznych ujawnia potencjalnie
ważne mutacje.
∆500-532 w obszarze kodowania NSP1 koreluje z niższym wirusem
3. ładunek i IFN-β w surowicy.
4. Izolaty viralne z mutacją ∆500-532 indukują niższe IFN-I
Odpowiedź w zainfekowanych komórkach.
Projekt eksperymentalny
Osiągnięcia
1. COVID-19 Nadzór epidemiologiczny i genomowy
Dane kliniczne zebrano w prowincji Syczuan, Chiny w okresie wybuchu od 22 stycznia 2020 r. Do 20 lutego 2020 r. W sumie 538 przypadków Covid-19 potwierdzono testami QPCR w Syczuanie, z których 28,8% pochodziło z prowincji kapitał. Potwierdzone przypadki w Syczuanie wzrosły wykładniczo, osiągając szczyt 30 stycznia. Ponadto dane potwierdziły, że dystans społeczny może być kluczowym czynnikiem zapobiegania rozprzestrzenianiu się wirusa.
Rycina 1. Badanie epidemiologiczne Covid-19 w prowincji Syczuan w Chinach
2. Konstrukcja genomu SARS-COV-2 i identyfikacja wariantów
Dzięki amplifikacji multipleksu PCR, a następnie sekwencjonowania nanoporów, wygenerowano ogółem 310 genomów bliskich lub częściowych od 248 pacjentów z ok. 80% genomów objętych 10 odczytami (średnia głębokość: 0,39 m odczytów na próbkę).
Ryc. 2. Częstotliwość każdego wariantu w grupie Syczuana
Z zidentyfikowano w sumie 104 SNP i 18 indeli z genomów SARS-COV-2, w których zidentyfikowano 31 SNP i 4 indeli jako powtarzające się warianty genetyczne. Porównując je z 169 próbkami z Wuhan i z 81 391 wysokiej jakości sekwencji genomu publicznego w GISAID, 29 z 35 wariantów znalezionych na innych kontynentach. W szczególności stwierdzono, że cztery warianty, w tym ∆500-532, ACC18108AT, ∆729-737 i T13243C, występują tylko w Syczuanie i Wuhan i nieobecne w danych GISAID, co wskazuje, że te warianty były najważniejsze z Wuhan, które spełniają się z Wuhan, które spełniają się z Wuhan, które spełniają się z Wuhan. Rekordy podróży pacjentów.
Analiza ewolucyjna z metodą maksymalnego prawdopodobieństwa (ML) i podejściem bayesowskiego zegara molekularnego przetworzono na 88 nowych wirusach Sichuan i 250 wyczerpanych genomów z innych regionów. Genomy z ∆500-532 (delecje w regionie kodującym NSP1) znaleziono rzadko rozmieszczone w drzewie filogenetycznym. Analiza haplotypów na wariantach NSP1 zidentyfikowała 5 z nich z wielu miast. Wyniki te sugerują, że ∆500-532 wystąpił w wielu miastach i mogą być importowane wiele razy z Wuhan.
Rycina 2. Powtarzające się warianty genetyczne i analiza filogenetyczna w genomach SARS-COV-2
3. Związek powtarzających się wariantów genetycznych z implikacjami klinicznymi
117 Fenotypy kliniczne było związane z nasileniem COVID-19, gdzie 19 fenotypów związanych z nasileniem sklasyfikowano na ciężkie i nieokrzeczące się cech. Związek między tymi cechami a 35 powtarzającymi się wariantami genetycznymi zostały zwinięte w mapie cieplnej bi-klasterowej. Analiza wzbogaconego podobnego do GSEA wykazała, że ∆500-532 jest ujemnie skorelowana z liczbą komórek T IFN-β i CD3+ CD8+ CD3+ CD3+. Ponadto testy QPCR wykazały, że pacjenci zakażani wirusem zawierającym ∆500-532 mieli najwyższą wartość CT, tj. Najniższe obciążenie wirusowe.
Rycina 3. Związki 35 nawracających wariantów genetycznych z fenotypami klinicznymi
4. Walidacja fenotypów klinicznych związanych z mutacją wirusową
Aby zrozumieć wpływ ∆500-532 na funkcje NSP1, komórki HEK239T transfekowano plazmidami wyrażającymi pełną długość, WT NSP1 i zmutowanych form z delecjami. Profile transkryptomu każdego traktowanych komórek HEK239T przetworzono do analizy PCA, pokazując, że mutanty delecyjne skupiły się stosunkowo bliżej i znacząco różnią się od WT NSP1. Geny, które były znacząco regulowane w górę u mutantów, były głównie wzbogacone w „biosyntetyczny proces biosyntetyczny/metaboliczny”, „Biogenezę z kompleksu rybonukleoprotein”, „Kierowanie białka do błony/ER” itp. Dwa delety wykazały wyraźny wzór Expssion z WT.
Rycina 4. Analiza transkryptomu na komórkach HEK239T transfekowanych przez WT NSP1 i z delecjami
Wpływ delecji na odpowiedź IFN-1 badano również w badaniu nadekspresji. Wykazano, że wszystkie testowane delecje zmniejszają powtórzenie IFN-1 w transfekowanych komórkach HEK239T i A549 zarówno na poziomie transkryptomu, jak i poziomu białka. Co ciekawe, znacząco obniżone geny w delecjach zostały wzbogacone w „reakcję obronną na wirusa”, „replikację genomu wirusowego”, „Regulacja transkrypcji przez polimerazę RNA II” i „odpowiedź na interferon typu I”.
Rycina 5. Down regulacja szlaków sygnałowych interferonu w mutancie ∆500-532
W tym badaniu wpływ tych delecji na wirusa został dodatkowo potwierdzony przez badania infekcji wirusowej. Wirusy z niektórymi mutantami izolowano z próbek klinicznych i zakażono do komórek Calu-3. Szczegółowe wyniki badania infekcji wirusowej można odczytać w artykule.
doi:10.1016/j.chom.2021.01.015
Odniesienie
Lin J, Tang C, Wei H, i in. Monitorowanie genomowe SARS-COV-2 odkrywa wariant delecji NSP1, który moduluje odpowiedź interferonu typu I [J]. Host komórkowy i mikrobe, 2021.
Wiadomości i najważniejsze wydarzenia Ma na celu dzielenie się najnowszymi udanymi przypadkami z technologiami biomarkerów, rejestrowanie nowych osiągnięć naukowych, a także znaczące techniki stosowane podczas badania.
Czas postu: 06-2022