Hele genom resequening
Genomikkovervåking av SARS-COV-2 avdekker en NSP1-slettingsvariant som modulerer type I interferonrespons
Nanopore | Illumina | Hele genom resequencing | Metagenomics | RNA-seq | Sanger
Biomarkørteknologier ga teknisk støtte for utvalgssekvensering i denne studien.
Høydepunkter
1.SARS-COV-2 genomsekvensering og fylognetisk analyse Identifiser 35 tilbakevendende mutasjoner inkludert 31 SNP og 4 indeller.
2. Association med 117 kliniske fenotyper avslører potensielt
viktige mutasjoner.
∆500-532 i NSP1-kodingsregionen korrelerer med lavere viral
3.Last og serum IFN-ß.
4.virale isolater med ∆500-532 mutasjon induserer lavere IFN-I
respons i de infiserte cellene.
Eksperimentell design
Prestasjoner
1. Covid-19 epidemiologisk og genomisk overvåking
Kliniske data ble samlet inn i Sichuan-provinsen, Kina over utbruddstiden fra 22. jan kapital. Bekreftede saker i Sichuan økte eksponentielt, og toppet 30. januar. Data støttet at sosial distansering kan være en nøkkelfaktor for å forhindre spredning av viruer.
Figur 1. Epidemiologisk studie av Covid-19 i Sichuan-provinsen, Kina
2. SARS-COV-2 Genomkonstruksjon og identifikasjon av varianter
Med multiplex PCR-amplifisering etterfulgt av nanopore-sekvensering, ble totalt 310 nær eller delvis fullstendig genom fra 248 pasienter generert med ca. 80% av genomene dekket av 10 avlesninger (gjennomsnittlig dybde: 0,39 m leser per prøve).
Figur 2. Frekvens av hver varianter i Sichuan -kohorten
Totalt 104 SNP og 18 indeler ble identifisert fra SARS-COV-2-genomer, der 31 SNP og 4 indeler ble identifisert som tilbakevendende genetiske varianter. Ved å sammenligne dem med 169 prøver fra Wuhan og med 81.391 høykvalitets publik-genomsekvenser i Gisaid, 29 av de 35 variantene som ble funnet presentert i andre kontinenter. Spesielt ble fire varianter inkludert ∆500-532, ACC18108AT, ∆729-737 og T13243C, bare funnet å presentere i Sichuan og Wuhan og fraværende i Gisaid-data, noe som indikerte at disse variantene veldig sannsynlig var imponert fra Wuhan, som som oppfyller The som møtes som de som oppfyller de variantene reisejournaler over pasienter.
Evolusjonsanalyse med maksimal sannsynlighet (ML) -metode og Bayesian Molecular Clock -tilnærminger ble behandlet på 88 nye virus SFrom Sichuan og 250 kuraterte genomer fra andre regioner. Genomer med ∆500-532 (sletting i NSP1-kodingsregionen) ble funnet fordelt tynt i det fylogenetiske treet. Haplotypeanalyse på NSP1 -varianter identifiserte 5 av dem fra flere byer. Disse resultatene antydet at ∆500-532 skjedde i flere byer og kan importeres flere ganger fra Wuhan.
Figur 2. Gjentakende genetiske varianter og fylogenetisk analyse i SARS-CoV-2-genomene
3. Forening av tilbakevendende genetiske varianter med kliniske implikasjoner
117 Kliniske fenotyper var assosiert med Covid-19 alvorlighetsgrad, der 19 alvorlighetsrelaterte fenotyper ble klassifisert til alvorlige og ikke-alvorlige egenskaper. Forholdet mellom disse egenskapene og 35 tilbakevendende genetiske varianter ble viualisert i bi-klyngen varmekart. En GSEA-lignende rangert berikelsesanalyse viste at ∆500-532 er negativt korrelert med ESR, serum IFN-ß og CD3+ CD8+ T-celletall i blodet. Videre viste qPCR-tester at pasienter infisert med virus som har ∆500-532 hadde den høyeste CT-verdien, dvs. laveste viral belastning.
Figur 3. Assosiasjoner av 35 tilbakevendende genetiske varianter med kliniske fenotyper
4. Validering på viral mutasjon assosierte kliniske fenotyper
For å forstå påvirkningene av ∆500-532 på NSP1-funksjoner, ble HEK239T-celler transfektert med plasmider som uttrykker full lengde, WT NSP1 og mutante former med deletjoner. Transkriptomprofiler av hver behandlede HEK239T -celler ble behandlet for PCA -analyse, og viste at slettemutanter grupperte relativt nærmere og var betydelig forskjellig fra WT NSP1. Genene som ble signifikant oppregulert i mutantene ble hovedsakelig beriket i "peptidbiosyntetisk/metabolsk prosess", "ribonukleoproteinkompleks biogenese", "proteinmålretting til membran/er", etc. Videre viste to deletions et distinkt ekspedisjonsmønster fra WT.
Figur 4. Transkriptomanalyse på HEK239T -celler transfektert av WT NSP1 og det med slettinger
Effektene av sletting av IFN-1-respons ble også testet i overuttrykt studie. Alle testede slettinger ble vist å redusere IFN-1-repsonse i transfekterte HEK239T og A549-celler på både transkriptomnivå og proteinnivå. Interessant nok ble de betydelig nedregulerte genene i sletting beriket i "forsvarsrespons på virus", "viral genomreplikasjon", "regulering av transkripsjon ved RNA-polymerase II" og "respons på type I-interferon".
Figur 5. Nedregulering av interferon signalveier i ∆500-532 mutant
I denne studien ble virkningen av disse slettingene på virus ytterligere bekreftet ved virusinfeksjonsstudier. Virus med visse mutanter ble isolert fra kliniske prøver og infisert til CALU-3-celler. Detaljerte resultater på virusinfeksjonsstudie kan leses i papiret.
doi:10.1016/j.chom.2021.01.015
Referanse
Lin J, Tang C, Wei H, et al. Genomisk overvåking av SARS-COV-2 avdekker en NSP1-slettingsvariant som modulerer type I interferonrespons [J]. Cell Host & Microbe, 2021.
Nyheter og høydepunkter Målet med å dele de siste vellykkede sakene med biomarkørteknologier, fange nye vitenskapelige prestasjoner samt fremtredende teknikker som ble brukt under studien.
Post Time: Jan-06-2022