De isolatie van kernen wordt bereikt door 10× Genomics Chromium™, dat bestaat uit een achtkanaals microfluïdicasysteem met dubbele kruisingen. In dit systeem worden gelkralen met streepjescodes en primer, enzymen en een enkele kern ingekapseld in een oliedruppel ter grootte van een nanoliter, waardoor Gel Bead-in-Emulsion (GEM) ontstaat. Zodra GEM is gevormd, worden in elke GEM cellyse en het vrijgeven van streepjescodes uitgevoerd. mRNA wordt omgekeerd getranscribeerd in cDNA-moleculen met 10x barcodes en UMI, die verder onderworpen zijn aan de standaardconstructie van sequencing-bibliotheken.
● Bereiding van suspensie van enkele kernen uit bevroren weefsels
● Vorming van Gel Bead-in-Emulsion (GEM), gevolgd door cDNA-synthese
● Elke kraal in een GEM is geladen met primers die uit 4 secties bestaan:
poly(dT) staart voor mRNA-priming en cDNA-synthese,
Unieke Moleculaire Identificatie (UMI) om amplificatiebias te corrigeren
10x streepjescode
Bindende sequentie van gedeeltelijk gelezen 1-sequencingprimer
Single-nucleus RNA-sequencing omzeilt de beperkingen van single-cell RNA-sequencing, waardoor:
● Het gebruik van bevroren monsters en niet alleen beperkt tot verse monsters
● Lage stress van ingevroren cellen vergeleken met enzymatische behandeling van verse cellen, weerspiegeld in de transcriptoomgegevens in de vorm van minder door stress geïnduceerde genen
● Er is geen voorafgaande verwijdering van rode bloedcellen nodig
● Onbeperkte celdiameter
● Grote reeks monsters die in aanmerking komen voor analyse, inclusief complexe en kwetsbare weefseltypen die gevoelig zijn voor celklontering of -vernietiging tijdens weefseldissociatie
Cel / Weefsel | Reden |
Onvers bevroren weefsel | Kan geen nieuwe of lang bewaarde organisaties ophalen |
Spiercel, megakaryocyt, vet… | De celdiameter is te groot om in het instrument te komen |
Lever… | Te kwetsbaar om te breken, niet in staat afzonderlijke cellen te onderscheiden |
Neuroncel, Hersenen… | Gevoeliger, gemakkelijk te benadrukken, zal de sequentieresultaten veranderen |
Alvleesklier, schildklier… | Rijk aan endogene enzymen, die de productie van eencellige suspensie beïnvloeden |
Enkele kern | Eencellig |
Onbeperkte celdiameter | Celdiameter: 10-40 μm |
Het materiaal kan bevroren weefsel zijn | Het materiaal moet vers weefsel zijn |
Lage stress van bevroren cellen | Enzymbehandeling kan een celstressreactie veroorzaken |
Er hoeven geen rode bloedcellen verwijderd te worden | Rode bloedcellen moeten worden verwijderd |
Nucleair drukt bio-informatie uit | De hele cel brengt bio-informatie tot expressie |
Voorbeeldvereisten | Bibliotheek | Sequentiestrategie | Gegevens aanbevolen | Kwaliteitscontrole |
Dierlijk weefsel ≥ 200 mg Plantenweefsel ≥ 400 mg | 10x Genomics sn cDNA-bibliotheek | Illumina PE150 | 100K PE-metingen per cel (100-200 GB) | 700-1200 kernen/μl en integriteit van de kernen waargenomen onder de microscoop |
Voor meer informatie over begeleiding bij monstervoorbereiding en serviceworkflow kunt u gerust contact opnemen met eenBMKGENE-expert
Bevat de volgende analyse:
● Kwaliteitscontrole: aantal cellen, gendetectie, nauwkeurige identificatie van cellen, RNA-moleculen en kwantificering van expressie
● Innerlijke monsteranalyse:
Celclustering en clusterannotatie
Differentiële expressieanalyse: identificatie van DEG's in clusters
Functionele annotatie en verrijking van cluster DEG's
● Intergroepsanalyse:
Combinatie van gegevens
Differentiële expressieanalyse: identificatie van DEG's in groepen
Functionele annotatie en verrijking van groeps-DEG's
● Geavanceerde analyse:
Celcyclusanalyse
Pseudotime-analyse
Analyse van mobiele communicatie (CellPhoneDB)
Gene Set Enrichment Analysis (GSEA)
Analyse van binnenmonsters
Celclustering:
Differentiële expressieanalyse: cluster DEG's
Intergroepsanalyse
Differentiële expressieanalyse: groeps-DEG's
Geavanceerde analyse:
Pseudotijdanalyse:
Celcyclusanalyse:
Ontdek de vooruitgang die mogelijk wordt gemaakt door de single-nucleus RNA-sequencing-diensten van BMKGene door 10X Chromium in deze aanbevolen publicaties:
Wang, L. et al. (2021) 'Single-cell transcriptomische analyse onthult het immuunlandschap van de longen bij steroïde-resistente astma-exacerbatie',Proceedings van de National Academy of Sciences van de Verenigde Staten van Amerika, 118(2), p. e2005590118. doi: 10.1073/pnas.2005590118
Zheng, H. et al. (2022) 'Een mondiaal regelgevingsnetwerk voor ontregelde genexpressie en abnormale metabolische signalering in immuuncellen in de micro-omgeving van de ziekte van Graves en de schildklierontsteking van Hashimoto',Grenzen in de immunologie, 13, blz. 879824. doi: 10.3389/FIMMU.2022.879824/BIBTEX.
Tian, H. et al. (2023) 'Eencellig transcriptoom onthult heterogeniteit en immuunreacties van leukocyten na vaccinatie met geïnactiveerde Edwardsiella tarda in bot (Paralichthys olivaceus)',Aquacultuur, 566, blz. 739238. doi: 10.1016/J.AQUACULTURE.2023.739238.
Yu, Y. et al. (2023) 'Fotodynamische therapie verbetert de uitkomst van immuuncheckpointremmers via het hermodelleren van de antitumorimmuniteit bij patiënten met maagkanker',Maagkanker, 26(5), blz. 798–813. doi: 10.1007/S10120-023-01409-X/METRICS.