Single- nuclei RNA Sequencing
နည်းပညာပိုင်းဆိုင်ရာအစီအစဉ်
နျူကလိယ၏ အထီးကျန်မှုကို 10× Genomics Chromium™ က ရရှိပြီး လမ်းကြောင်းနှစ်ထပ်ရှိသော microfluidics စနစ်ပါ၀င်သည်။ ဤစနစ်တွင်၊ ဘားကုဒ်များနှင့် primer၊ အင်ဇိုင်းများနှင့် နျူကလိယတစ်ခုပါရှိသော ဂျယ်လ်ပုတီးစေ့များကို နာနိုလီတာအရွယ် အဆီတစ်စက်တွင် ထုပ်ပိုးထားပြီး Gel Bead-in-Emulsion (GEM) ကို ထုတ်ပေးပါသည်။ GEM ကိုဖွဲ့စည်းပြီးသည်နှင့် GEM တစ်ခုစီတွင် cell lysis နှင့် barcode များထုတ်လွှတ်ခြင်းကိုလုပ်ဆောင်သည်။ mRNA ကို 10× ဘားကုဒ်များနှင့် UMI ပါရှိသော cDNA မော်လီကျူးများအဖြစ် ပြောင်းပြန် ကူးယူဖော်ပြသည်၊၊ ၎င်းသည် စံသတ်မှတ်ထားသော စာကြည့်တိုက်တည်ဆောက်မှု၏ နောက်ထပ်အကြောင်းအရာဖြစ်သည်။
အင်္ဂါရပ်များ
● အေးခဲနေသော တစ်ရှူးများမှ နျူကလိယ ဆိုင်းထိန်းမှု တစ်ခုတည်းကို ပြင်ဆင်ခြင်း။
● Gel Bead-in-Emulsion (GEM) ၏နောက်တွင် cDNA ပေါင်းစပ်ခြင်းဖြင့်၊
● GEM တစ်ခုရှိ bead တစ်ခုစီတွင် အပိုင်း 4 ပိုင်းပါဝင်သည့် primers များပါရှိသည်-
mRNA priming နှင့် cDNA ပေါင်းစပ်မှုအတွက် poly(dT) အမြီး၊
ချဲ့ထွင်မှုဆိုင်ရာ ဘက်လိုက်မှုကို မှန်ကန်စေရန် သီးသန့် မော်လီကျူး အမှတ်အသား (UMI)
10x ဘားကုဒ်
တစ်စိတ်တစ်ပိုင်းဖတ်ရန် 1 sequencing primer ၏ စည်းနှောင်မှု အတွဲ
အားသာချက်များ
Single-nucleus RNA sequencing သည် single-cell RNA sequencing ၏ ကန့်သတ်ချက်များကို ကျော်လွှားနိုင်ပြီး၊
● အေးခဲထားသောနမူနာများကို အသုံးပြုခြင်းနှင့် လတ်ဆတ်သောနမူနာများအတွက်သာ ကန့်သတ်ထားခြင်းမရှိပါ။
● ဖိစီးမှုနည်းသော မျိုးဗီဇပုံစံဖြင့် စာသားမှတ်တမ်းဒေတာတွင် ထင်ဟပ်နေသည့် လတ်ဆတ်သောဆဲလ်များ၏ အင်ဇိုင်းဖြင့်ကုသခြင်းနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက အေးခဲနေသောဆဲလ်များ၏ ဖိအားနည်းသည်
● သွေးနီဥများကို ကြိုတင်ဖယ်ရှားရန် မလိုအပ်ပါ။
● အကန့်အသတ်မရှိ ဆဲလ်အချင်း
● တစ်ရှူးကွဲသွားချိန်တွင် ဆဲလ်များစုပုံခြင်း သို့မဟုတ် ပျက်စီးခြင်းသို့ကျရောက်နိုင်သော ရှုပ်ထွေးပြီး ပျက်စီးလွယ်သော တစ်ရှူးအမျိုးအစားများအပါအဝင် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက် အရည်အချင်းပြည့်မီသော ကြီးမားသောနမူနာများ
single-cell RNA sequencing ဖြင့်ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာ၍မရသောနမူနာများနှင့် single nuclei RNA sequencing အတွက် အရည်အချင်းပြည့်မီသည်-
| ဆဲလ်/တစ်ရှူး | အကြောင်းပြချက် |
| အေးခဲနေသော တစ်ရှူးများကို မလန်းဆန်းပါ။ | လတ်ဆတ်သော သို့မဟုတ် တာရှည်သိမ်းဆည်းထားသော အဖွဲ့အစည်းများကို ရယူ၍မရပါ။ |
| ကြွက်သားဆဲလ်၊ Megakaryocyte၊ အဆီ... | တူရိယာကို ထည့်သွင်းရန် ဆဲလ်အချင်းသည် ကြီးလွန်းသည်။ |
| အသည်း… | ဆဲလ်တစ်ခုတည်းကို မခွဲခြားနိုင်လောက်အောင် ကွဲလွယ်သည်။ |
| အာရုံကြောဆဲလ်၊ ဦးနှောက်... | ပိုမိုထိခိုက်လွယ်သော၊ ဖိစီးရန်လွယ်ကူသည်၊ ဆက်တိုက်ရလဒ်များကို ပြောင်းလဲလိမ့်မည်။ |
| ပန်ကရိယ၊ သိုင်းရွိုက်... | endogenous အင်ဇိုင်းများ ကြွယ်ဝစွာပါဝင်ပြီး single cell suspension ထုတ်လုပ်မှုကို ထိခိုက်စေပါသည်။ |
Single-nucleus နှင့် Single-cell
| လုံးချင်းတို့ဖြစ်သည်။ | ဆဲလ်တစ်ခုတည်း |
| အကန့်အသတ်မရှိ ဆဲလ်အချင်း | ဆဲလ်အချင်း: 10-40 μm |
| အဆိုပါပစ္စည်းကိုအေးခဲတစ်ရှူးနိုင်ပါတယ်။ | ပစ္စည်းသည် လတ်ဆတ်သော တစ်ရှူးဖြစ်ရမည်။ |
| အေးခဲနေသောဆဲလ်များ၏ ဖိအားနည်းသည်။ | အင်ဇိုင်းကုသမှုသည် ဆဲလ်ဖိစီးမှုတုံ့ပြန်မှုကို ဖြစ်စေနိုင်သည်။ |
| သွေးနီဥတွေကို ဖယ်ရှားဖို့ မလိုအပ်ပါဘူး။ | သွေးနီဥတွေကို ဖယ်ရှားဖို့ လိုပါတယ်။ |
| Nuclear သည် ဇီဝအချက်အလက်များကို ဖော်ပြသည်။ | ဆဲလ်တစ်ခုလုံးသည် ဇီဝအချက်အလက်များကို ဖော်ပြသည်။ |
သတ်မှတ်ချက်များ
| နမူနာလိုအပ်ချက်များ | စာကြည့်တိုက် | Sequence ဗျူဟာ | ဒေတာအကြံပြုထားသည်။ | အရည်အသွေးထိန်းချုပ်မှု |
| တိရစ္ဆာန်တစ်သျှူး ≥ 200 မီလီဂရမ် အပင်တစ်သျှူး ≥ 400 မီလီဂရမ် | 10x Genomics sn cDNA စာကြည့်တိုက် | Illumina PE150 | ဆဲလ်တစ်ခုလျှင် PE 100K ဖတ်သည်။ (100-200 Gb) | အဏုကြည့်မှန်ဘီလူးအောက်တွင် 700-1200 nuclei/μl နှင့် နျူကလိယ သမာဓိရှိမှု |
နမူနာပြင်ဆင်မှုလမ်းညွှန်နှင့် ဝန်ဆောင်မှုလုပ်ငန်းအသွားအလာဆိုင်ရာ အသေးစိတ်အချက်အလက်များအတွက် ကျေးဇူးပြု၍ တစ်ဦးနှင့်စကားပြောပါ။BMKGENE ကျွမ်းကျင်သူ
Service Work Flow
အောက်ပါ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု ပါဝင်သည်-
● အရည်အသွေးထိန်းချုပ်မှု- ဆဲလ်အရေအတွက်၊ မျိုးရိုးဗီဇရှာဖွေမှု၊ ဆဲလ်များ၏တိကျသောခွဲခြားသတ်မှတ်မှု၊ RNA မော်လီကျူးများနှင့် စကားရပ်အရေအတွက်
● အတွင်းနမူနာ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း-
ဆဲလ်အစုအဝေးနှင့် အစုလိုက် မှတ်ချက်
Differential Expression ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း- အစုအဝေးများရှိ DEG များကို ခွဲခြားသတ်မှတ်ခြင်း။
လုပ်ဆောင်နိုင်သော မှတ်ချက်များနှင့် DEG အစုအဝေးများ၏ ကြွယ်ဝမှု
● အုပ်စုအချင်းချင်း ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း-
ဒေတာပေါင်းစပ်
ကွဲပြားသောဖော်ပြချက် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း- အုပ်စုများအတွင်း DEG များကို ခွဲခြားသတ်မှတ်ခြင်း။
လုပ်ဆောင်နိုင်သော မှတ်ချက်များနှင့် အုပ်စု DEGs များ၏ ကြွယ်ဝမှု
● အဆင့်မြင့် ပိုင်းခြားစိတ်ဖြာချက်-
ဆဲလ်လည်ပတ်မှု ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း။
Pseudotime ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာ
ဆဲလ်ဖုန်းဆက်သွယ်မှု ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း (CellPhoneDB)
Gene Set Enrichment Analysis (GSEA)
အတွင်းပိုင်းနမူနာခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာ
ဆဲလ်စုဖွဲ့ခြင်း-
ကွဲပြားသော ဖော်ပြချက် ပိုင်းခြားစိတ်ဖြာချက်- DEG အစုအဝေးများ
အုပ်စုအချင်းချင်း ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း။
ကွဲပြားသော ဖော်ပြချက် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု- အုပ်စု DEGs
အဆင့်မြင့် ပိုင်းခြားစိတ်ဖြာချက်-
Pseudotime ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု-
ဆဲလ်လည်ပတ်မှု ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု-
BMKGene ၏ 10X Chromium မှ 10X Chromium ဖြင့် BMKGene ၏ single-nucleus RNA sequencing ဝန်ဆောင်မှုများမှ ပံ့ပိုးပေးထားသည့် တိုးတက်မှုများကို စူးစမ်းလေ့လာပါ-
Wang, L. et al. (2021) 'Single-cell transcriptomic analysis သည် steroid-ခံနိုင်ရည်ရှိသော ပန်းနာရင်ကျပ်ရောဂါကို ပိုမိုဆိုးရွားစေခြင်းတွင် အဆုတ်၏ခုခံအားရှုခင်းကို ပြသသည်'၊အမေရိကန်ပြည်ထောင်စု၏ အမျိုးသားသိပ္ပံအကယ်ဒမီ၏ လုပ်ငန်းစဉ်များ, 118(2), p. e2005590118။ doi: 10.1073/pnas.2005590118
Zheng, H. et al. (2022) 'Global Regulatory Network for Dysregulated Gene Expression and Abnormal Metabolic Signaling in the Microenvironment of Graves' Disease and Hashimoto's Thyroiditis'၊Immunology ရှိ နယ်ခြားများ, 13, p ။ 879824. doi: 10.3389/FIMMU.2022.879824/BIBTEX။
Tian, H. et al. (2023) 'Single-cell transcriptome သည် flounder (Paralichthys olivaceus) တွင် အသက်မဝင်သော Edwardsiella tarda အား ကာကွယ်ဆေးထိုးပြီးနောက် leukocytes ၏ မျိုးကွဲကွဲပြားမှုနှင့် ကိုယ်ခံအားတုံ့ပြန်မှုများကို ဖော်ထုတ်ပေးသည်'၊ငါးပုစွန်, 566, p ။ 739238. doi: 10.1016/J.AQUACULTURE.2023.739238.
Yu, Y. et al ။ (2023) 'Photodynamic therapy သည် အစာအိမ်ကင်ဆာရှိလူနာများတွင် အကျိတ်ဆန့်ကျင်ဘက်ကိုယ်ခံအားကို ပြန်လည်ပြုပြင်ခြင်းမှတစ်ဆင့် ခုခံအားစစ်ဆေးရေးဂိတ် inhibitors များ၏ရလဒ်ကို တိုးတက်စေသည်'၊အစာအိမ်ကင်ဆာ၊ ၂၆(၅)၊ စ၊ ၇၉၈–၈၁၃။ doi- 10.1007/S10120-023-01409-X/METRICS။
