PacBio 2+3 full-Length mRNA ဖြေရှင်းချက်
အင်္ဂါရပ်များ
● လေ့လာမှု ဒီဇိုင်း-
စာသားမှတ်တမ်း isoform များကိုခွဲခြားသတ်မှတ်ရန် PacBio ဖြင့် ပေါင်းစပ်ထားသောနမူနာ
သီးခြားနမူနာများ (ပုံတူများနှင့် စမ်းသပ်ရမည့် အခြေအနေများ) ဖြင့် စီထားသည်။စာသားအသုံးအနှုန်းကို အရေအတွက်သတ်မှတ်ရန် NGS
● PacBio sequencing သည် CCS မုဒ်တွင် HiFi ဖတ်မှုများကို ဖန်တီးပေးသည်။
● အပြည့်အစုံ စာသားမှတ်တမ်းများကို စီစစ်ခြင်း။
● ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်းသည် ရည်ညွှန်းဂျီနိုမ်ကို မလိုအပ်ပါ။ သို့သော် ၎င်းကို အလုပ်ခန့်နိုင်သည်။
● Bioinformatic analysis တွင် gene နှင့် isoform-level တွင် ဖော်ပြခြင်းသာမက lncRNA၊ gene ပေါင်းစပ်မှုများ၊ poly-adenylation နှင့် gene structure တို့ပါ၀င်သည်
အားသာချက်များ
● မြင့်မားသောတိကျမှု- HiFi သည် တိကျမှု > 99.9% (Q30) ဖြင့် NGS နှင့် ယှဉ်နိုင်သည်
● အစားထိုး ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း: စာသားမှတ်တမ်းများအားလုံးကို စီတန်းခြင်းသည် isoform ခွဲခြားသတ်မှတ်ခြင်းနှင့် စရိုက်လက္ခဏာကို လုပ်ဆောင်ပေးသည်။
● PacBio နှင့် NGS အားသာချက်များ ပေါင်းစပ်ခြင်း။: isoform အဆင့်တွင် ဖော်ပြမှုပမာဏကို ဖွင့်ပေးခြင်း၊ ဗီဇဖော်ပြချက်တစ်ခုလုံးကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာသောအခါတွင် ဖုံးကွယ်ထားနိုင်သည့် အပြောင်းအလဲကို ထုတ်ဖော်ပြသခြင်း
● ကျယ်ပြန့်သော ကျွမ်းကျင်မှု: PacBio မှတ်တမ်းအပြည့်အစုံ ပရောဂျက်ပေါင်း 1100 ကျော်ကို အပြီးသတ်ပြီး နမူနာ 2300 ကျော်ကို လုပ်ဆောင်ခြင်း၏ မှတ်တမ်းနှင့်အတူ၊ ကျွန်ုပ်တို့အဖွဲ့သည် ပရောဂျက်တိုင်းအတွက် အတွေ့အကြုံများစွာကို ယူဆောင်လာပါသည်။
● အရောင်းလွန်မှု ပံ့ပိုးမှု: ကျွန်ုပ်တို့၏ ကတိကဝတ်သည် 3-လ-ရောင်းချပြီးနောက်ဝန်ဆောင်မှုကာလနှင့်အတူ ပရောဂျက်ပြီးမြောက်ခြင်းထက် ကျော်လွန်ပါသည်။ ဤအချိန်အတောအတွင်း၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ရလဒ်များနှင့်သက်ဆိုင်သည့် မည်သည့်မေးခွန်းများကိုမဆို ဖြေရှင်းရန်အတွက် ပရောဂျက်နောက်ဆက်တွဲ၊ ပြဿနာဖြေရှင်းခြင်းအကူအညီနှင့် အမေးအဖြေကဏ္ဍများကို ပေးဆောင်ပါသည်။
နမူနာလိုအပ်ချက်များနှင့် ပေးပို့ခြင်း။
| စာကြည့်တိုက် | Sequence ဗျူဟာ | ဒေတာအကြံပြုထားသည်။ | အရည်အသွေးထိန်းချုပ်ရေး |
| PolyA ကြွယ်ဝသော mRNA CCS စာကြည့်တိုက် | PacBio နောက်ဆက်တွဲ II PacBio Revio | 20/40 Gb 5/10 M CCS | Q30≥85% |
| Poly A ကြွယ်ဝသည်။ | Illumina PE150 | 6-10 Gb | Q30≥85% |
Nucleotides များ
|
| Conc.(ng/μl) | ပမာဏ (μg) | သန့်ရှင်းစင်ကြယ်ခြင်း။ | သမာဓိ |
| Illumina စာကြည့်တိုက် | ≥ ၁၀ | ≥ 0.2 | OD260/280=1.7-2.5 OD260/230=0.5-2.5 ဂျယ်တွင်ပြသထားသော ပရိုတင်း သို့မဟုတ် DNA ညစ်ညမ်းမှု အကန့်အသတ် သို့မဟုတ် မရှိပါ။ | အပင်များအတွက် RIN≥4.0; တိရစ္ဆာန်များအတွက် RIN≥4.5; 5.0≥28S/18S≥1.0; အကန့်အသတ် သို့မဟုတ် အခြေခံအဆင့်မြင့်ခြင်း |
| PacBio စာကြည့်တိုက် | ≥ 100 | ≥ 1.0 | OD260/280=1.7-2.5 OD260/230=0.5-2.5 ဂျယ်တွင်ပြသထားသော ပရိုတင်း သို့မဟုတ် DNA ညစ်ညမ်းမှု အကန့်အသတ် သို့မဟုတ် မရှိပါ။ | အပင်များ- RIN≥7.5 တိရစ္ဆာန်များ- RIN≥8.0 5.0≥28S/18S≥1.0; အကန့်အသတ် သို့မဟုတ် အခြေခံအဆင့်မြင့်ခြင်း |
နမူနာပေးပို့မှု အကြံပြုထားသည်။
ကွန်တိန်နာ- 2 ml centrifuge tube (Tin foil ကို မထောက်ခံပါ)
နမူနာတံဆိပ်ကပ်ခြင်း- အုပ်စု+ဥပမာ A1၊ A2၊ A3၊ B1, B2, B3 ။
တင်ပို့မှု-
1. ရေခဲခြောက်:နမူနာများကို အိတ်များတွင်ထုပ်ပြီး ရေခဲခြောက်ထဲတွင် မြှုပ်ထားရန် လိုအပ်သည်။
2. RNAstable tubes- RNA နမူနာများကို RNA stabilization tube (ဥပမာ RNAstable®) တွင် အခြောက်ခံပြီး အခန်းအပူချိန်တွင် တင်ပို့နိုင်ပါသည်။
အောက်ပါ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု ပါဝင်သည်-
ကုန်ကြမ်းဒေတာအရည်အသွေးထိန်းချုပ်မှု
အစားထိုး Polyadenylation ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း (APA)
Fusion စာသား ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း။
Alternative Splicing ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း။
Universal Single-Copy Orthologs (BUSCO) ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို စံသတ်မှတ်ခြင်း။
Novel transcript ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း- ကုဒ်နံပါတ်များ (CDS) ၏ ခန့်မှန်းချက်နှင့် လုပ်ဆောင်နိုင်သော မှတ်ချက်
lncRNA ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု- lncRNA နှင့် ပစ်မှတ်များကို ခန့်မှန်းခြင်း။
MicroSatelite သတ်မှတ်ခြင်း (SSR)
ကွဲပြားစွာဖော်ပြသောစာသားများ (DETs) ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း။
Differentially Expressed Genes (DEGs) ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း။
DEGs နှင့် DETs များ၏ လုပ်ဆောင်နိုင်သော မှတ်ချက်
BUSCO ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု
Alternative Splicing ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း။
အစားထိုး Polyadenylation ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း (APA)
ကွဲပြားစွာဖော်ပြသော မျိုးရိုးဗီဇ (DEGs) နှင့် စာသားမှတ်တမ်းများ (DETs9 သရုပ်ခွဲမှု
DETs နှင့် DEGs များ၏ ပရိုတင်း-ပရိုတင်း အပြန်အလှန် ဆက်သွယ်မှုကွန်ရက်များ
BMKGene ၏ PacBio 2+3 ၏ အစအဆုံး mRNA အစီအမံဖြင့် ပံ့ပိုးပေးထားသော တိုးတက်မှုများကို စူးစမ်းလေ့လာပါ။
Chao, Q. et al. (2019) 'Populus stem transcriptome'၊ Plant Biotechnology Journal၊ 17(1)၊ စစ. 206-219။ doi- 10.1111/PBI.12958။
Deng, H. et al. (2022) 'Ascorbic Acid Content in Dynamic Changes in the Fruit Development and Viening of Actinidia latifolia (an Ascorbate- Rich Fruit Crop) and the Associated Molecular Mechanisms', International Journal of Molecular Sciences, 23(10), p. 5808. doi: 10.3390/IJMS23105808/S1။
Hua, X. et al. (2022) 'Paris polyphylla ရှိ bioactive polyphyllins ပါ၀င်သော biosynthetic pathway genes ၏ထိရောက်သောခန့်မှန်းချက်'၊ Communications Biology 2022 5:1၊ 5(1)၊ စ. 1-10။ doi- 10.1038/s42003-022-03000-z။
Liu, M. et al. (2023) 'ပေါင်းစပ် PacBio Iso-Seq နှင့် Illumina RNA-Seq ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း Tuta absoluta (Meyrick) Transcriptome and Cytochrome P450 Genes', Insects, 14(4), p. 363. doi: 10.3390/INSECTS14040363/S1။
Wang၊ Lijun et al။ (2019) 'Ricinus communis ရှိ ricinus communis တွင် ricinus communis တွင် ricinus communis ၏ ricinus အက်ဆစ် ဇီဝပေါင်းစပ်မှုကို ပိုမိုကောင်းမွန်စွာ နားလည်နိုင်စေရန် PacBio တစ်ခုတည်း-မော်လီကျူးကို အချိန်နှင့်တပြေးညီ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအား Illumina RNA စီစစ်ခြင်းကို အသုံးပြု၍ မှတ်တမ်းမှတ်ရာရှုပ်ထွေးမှုစစ်တမ်းတစ်ခု'၊ BMC Genomics၊ 20(1)၊ စ. 1-17။ doi- 10.1186/S12864-019-5832-9/FIGURES/7။
