အစအဆုံး mRNA စီစစ်ခြင်း -PacBio
အင်္ဂါရပ်များ
● poly-A mRNA မှ cDNA ပေါင်းစပ်မှုနောက်တွင် စာကြည့်တိုက်ပြင်ဆင်မှု
● CCS မုဒ်တွင် စီစစ်ခြင်း၊ HiFi ဖတ်ရှုခြင်းကို ထုတ်ပေးခြင်း။
● အပြည့်အစုံ စာသားမှတ်တမ်းများကို စီစစ်ခြင်း။
● ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုသည် ရည်ညွှန်းဂျီနိုမ်ကို မလိုအပ်ပါ။ သို့သော် ၎င်းကို အလုပ်ခန့်နိုင်သည်။
● Bioinformatic analysis သည် စာသားမှတ်တမ်းများ isoform lncRNA၊ gene fusions၊ poly-adenylation နှင့် gene structure တို့ကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာနိုင်သည်
ဝန်ဆောင်မှု အားသာချက်များ
●မြင့်မားသောတိကျမှု- HiFi သည် တိကျမှု > 99.9% (Q30) ဖြင့် NGS နှင့် ယှဉ်နိုင်သည်
● အစားထိုး ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း: စာသားမှတ်တမ်းတစ်ခုလုံးကို စီစစ်ခြင်းသည် isoform ခွဲခြားသတ်မှတ်ခြင်းနှင့် စရိုက်လက္ခဏာကို ဖြစ်ပေါ်စေသည်။
●ကျယ်ပြန့်သောကျွမ်းကျင်မှု: PacBio မှတ်တမ်းအပြည့်အစုံ ပရောဂျက်ပေါင်း 1100 ကျော်ကို ပြီးမြောက်အောင် လုပ်ဆောင်ပြီး နမူနာ 2300 ကျော်ကို လုပ်ဆောင်ခြင်း၏ မှတ်တမ်းနှင့်အတူ၊ ကျွန်ုပ်တို့အဖွဲ့သည် ပရောဂျက်တိုင်းအတွက် အတွေ့အကြုံများစွာကို ယူဆောင်လာပါသည်။
●အရောင်းလွန်မှု ပံ့ပိုးမှု: ကျွန်ုပ်တို့၏ ကတိကဝတ်သည် 3-လ-ရောင်းချပြီးနောက်ဝန်ဆောင်မှုကာလနှင့်အတူ ပရောဂျက်ပြီးမြောက်ခြင်းထက် ကျော်လွန်ပါသည်။ ဤအချိန်အတောအတွင်း၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ရလဒ်များနှင့်သက်ဆိုင်သည့် မည်သည့်မေးခွန်းများကိုမဆို ဖြေရှင်းရန်အတွက် ပရောဂျက်နောက်ဆက်တွဲ၊ ပြဿနာဖြေရှင်းခြင်းအကူအညီနှင့် အမေးအဖြေကဏ္ဍများကို ပေးဆောင်ပါသည်။
နမူနာလိုအပ်ချက်များနှင့် ပေးပို့ခြင်း။
| စာကြည့်တိုက် | Sequence ဗျူဟာ | ဒေတာအကြံပြုထားသည်။ | အရည်အသွေးထိန်းချုပ်မှု |
| PolyA ကြွယ်ဝသော mRNA CCS စာကြည့်တိုက် | PacBio နောက်ဆက်တွဲ II PacBio Revio | 20/40 Gb 5/10 M CCS | Q30≥85% |
နမူနာလိုအပ်ချက်များ-
Nucleotides-
● အပင်များ
အမြစ်၊ ပင်စည် သို့မဟုတ် ပန်းပွင့်: 450 မီလီဂရမ်
အရွက် သို့မဟုတ် အစေ့: 300 မီလီဂရမ်
အသီး: 1.2 ဂရမ်
● တိရစ္ဆာန်
နှလုံး သို့မဟုတ် အူ- 300 မီလီဂရမ်
ကလီစာ သို့မဟုတ် ဦးနှောက်: 240 မီလီဂရမ်
ကြွက်သား: 450 မီလီဂရမ်
အရိုး၊ ဆံပင် သို့မဟုတ် အရေပြား- 1g
● Arthropods-
အင်းဆက်များ : 6g
Crustacea: 300 မီလီဂရမ်
● သွေးတစ်ခုလုံး: 1 ပြွန်
● ဆဲလ်များ- 106 ဆဲလ်များ
| Conc.(ng/μl) | ပမာဏ (μg) | သန့်ရှင်းစင်ကြယ်ခြင်း။ | သမာဓိ |
| ≥ 100 | ≥ 1.0 | OD260/280=1.7-2.5 OD260/230=0.5-2.5 ဂျယ်တွင်ပြသထားသော ပရိုတင်း သို့မဟုတ် DNA ညစ်ညမ်းမှု အကန့်အသတ် သို့မဟုတ် မရှိပါ။ | အပင်များအတွက် RIN≥7.5; တိရစ္ဆာန်များအတွက် RIN≥8.0; 5.0≥ 28S/18S≥1.0; အကန့်အသတ် သို့မဟုတ် အခြေခံအဆင့်မြင့်ခြင်း |
နမူနာပေးပို့မှု အကြံပြုထားသည်။
ကွန်တိန်နာ- 2 ml centrifuge tube (Tin foil ကို မထောက်ခံပါ)
နမူနာတံဆိပ်ကပ်ခြင်း- အုပ်စု+ဥပမာ A1၊ A2၊ A3၊ B1, B2, B3 ။
တင်ပို့မှု-
1. ရေခဲခြောက်- နမူနာများကို အိတ်များတွင်ထုပ်ပိုးပြီး ရေခဲခြောက်ထဲတွင် မြှုပ်ထားရန် လိုအပ်သည်။
2. RNAstable tubes- RNA နမူနာများကို RNA stabilization tube (ဥပမာ RNAstable®) တွင် အခြောက်ခံပြီး အခန်းအပူချိန်တွင် တင်ပို့နိုင်ပါသည်။
Service Work Flow
စမ်းသပ်ထားတာ
နမူနာပေးပို့ခြင်း။
RNA ထုတ်ယူခြင်း။
စာကြည့်တိုက်တည်ဆောက်ရေး
Sequencing
ဒေတာခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာ
ရောင်းချပြီးနောက်ဝန်ဆောင်မှုများ
အောက်ပါ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု ပါဝင်သည်-
● ကုန်ကြမ်းဒေတာအရည်အသွေးထိန်းချုပ်မှု
● အစားထိုး Polyadenylation ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း (APA)
● Fusion မှတ်တမ်း ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း။
● အစားထိုး ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း
● Benchmarking Universal Single-Copy Orthologs (BUSCO) ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း။
● Novel transcript ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာ- ကုဒ်နံပါတ်များ (CDS) ၏ ခန့်မှန်းချက်နှင့် လုပ်ဆောင်နိုင်သော မှတ်စာများ
● lncRNA ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု- lncRNA နှင့် ပစ်မှတ်များကို ခန့်မှန်းခြင်း။
● MicroSatelite Identification (SSR)
BUSCO ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု
Alternative Splicing ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း။
အစားထိုး Polyadenylation ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း (APA)
ဝတ္ထုမှတ်တမ်းများ၏ လုပ်ဆောင်ချက်ဆိုင်ရာ မှတ်ချက်
ဤအသားပေးထုတ်ဝေမှုတွင် BMKGene ၏ Nanopore အစအဆုံး mRNA စီစစ်ခြင်းဝန်ဆောင်မှုများမှ ပံ့ပိုးပေးထားသည့် တိုးတက်မှုများကို စူးစမ်းလေ့လာပါ။
Ma, Y. et al ။ (2023) 'Nemopilema Nomurai အဆိပ်သတ်မှတ်ခြင်းအတွက် PacBio နှင့် ONT RNA ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာနည်းများကို နှိုင်းယှဉ်ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း'၊ Genomics၊ 115(6)၊ စ. 110709. doi: 10.1016/J.YGENO.2023.110709။
Chao, Q. et al. (2019) 'Populus stem transcriptome'၊ Plant Biotechnology Journal၊ 17(1)၊ စစ. 206-219။ doi- 10.1111/PBI.12958။
Deng, H. et al. (2022) 'Ascorbic Acid Content in Dynamic Changes in the Fruit Development and Viening of Actinidia latifolia (an Ascorbate- Rich Fruit Crop) and the Associated Molecular Mechanisms', International Journal of Molecular Sciences, 23(10), p. 5808. doi: 10.3390/IJMS23105808/S1။
Hua, X. et al. (2022) 'Paris polyphylla ရှိ bioactive polyphyllins ပါ၀င်သော biosynthetic pathway genes ၏ထိရောက်သောခန့်မှန်းချက်'၊ Communications Biology 2022 5:1၊ 5(1)၊ စ. 1-10။ doi- 10.1038/s42003-022-03000-z။
Liu, M. et al. (2023) 'ပေါင်းစပ် PacBio Iso-Seq နှင့် Illumina RNA-Seq ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း Tuta absoluta (Meyrick) Transcriptome and Cytochrome P450 Genes', Insects, 14(4), p. 363. doi: 10.3390/INSECTS14040363/S1။
Wang၊ Lijun et al။ (2019) 'Ricinus communis ရှိ ricinus communis တွင် ricinus communis တွင် ricinus communis ၏ ricinus အက်ဆစ် ဇီဝပေါင်းစပ်မှုကို ပိုမိုကောင်းမွန်စွာ နားလည်နိုင်စေရန် PacBio တစ်ခုတည်း-မော်လီကျူးကို အချိန်နှင့်တပြေးညီ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအား Illumina RNA စီစစ်ခြင်းကို အသုံးပြု၍ မှတ်တမ်းမှတ်ရာရှုပ်ထွေးမှုစစ်တမ်းတစ်ခု'၊ BMC Genomics၊ 20(1)၊ စ. 1-17။ doi- 10.1186/S12864-019-5832-9။
