Секвенционирање на РНК со единечни јадра
Техничка шема
Изолацијата на јадрата е постигната со 10× Genomics Chromium™, кој се состои од осумканален микрофлуиден систем со двојни вкрстувања. Во овој систем, зрнца од гел со баркодови и прајмер, ензими и едно јадро се инкапсулирани во капка масло со големина на нанолитар, генерирајќи Гел Беад-во-емулзија (GEM). Откако ќе се формира ГЕМ, во секој ГЕМ се врши лиза на клетките и ослободување на баркодови. mRNA се транскрибира обратно во cDNA молекули со 10× баркодови и UMI, кои понатаму се предмет на стандардна конструкција на библиотека за секвенционирање.
Карактеристики
● Подготовка на еднојадрена суспензија од замрзнати ткива
● Формирање на гел-бид-во-емулзија (GEM) проследено со синтеза на cDNA
● Секоја мушка во ГЕМ е наполнета со прајмери составени од 4 делови:
поли(dT) опашка за грундирање на mRNA и синтеза на cDNA,
Единствен молекуларен идентификатор (UMI) за корекција на пристрасноста на засилувањето
10x баркод
Секвенца за врзување на прајмер за секвенционирање делумно читање 1
Предности
Секвенционирањето на РНК со едно јадро ги заобиколува ограничувањата на едноклеточното секвенционирање на РНК, овозможувајќи:
● Употреба на замрзнати примероци и не само ограничена на свежи примероци
● Низок стрес на замрзнатите клетки во споредба со ензимската обработка на свежи клетки, рефлектирана во податоците за транскриптом во форма на гени предизвикани од помалку стрес
● Нема потреба од претходно отстранување на црвените крвни зрнца
● Неограничен дијаметар на ќелијата
● Голема низа примероци кои се подобни за анализа, вклучувајќи сложени и кревки типови ткива кои се склони кон згрутчување или уништување на клетките за време на ткивната дисоцијација
Примероците што не можат да се анализираат со едноклеточно секвенционирање на РНК и се подобни за секвенционирање на РНК на едно јадра:
| Клетка / Ткиво | Причина |
| Несвежено замрзнато ткиво | Не може да се добијат свежи или долго зачувани организации |
| Мускулни клетки, мегакариоцити, масти… | Дијаметарот на ќелијата е преголем за да влезе во инструментот |
| Црниот дроб… | Премногу кревка за да се скрши, не може да разликува поединечни клетки |
| Невронска клетка, мозок… | Почувствителен, лесен за стрес, ќе ги промени резултатите од секвенционирањето |
| Панкреас, тироидна жлезда… | Богата со ендогени ензими, кои влијаат на производството на едноклеточна суспензија |
Еднојадро наспроти Едноклетка
| Едно-јадро | Едноклеточни |
| Неограничен дијаметар на ќелијата | Дијаметар на ќелија: 10-40 μm |
| Материјалот може да биде замрзнато ткиво | Материјалот мора да биде свежо ткиво |
| Низок стрес на замрзнатите клетки | Ензимскиот третман може да предизвика клеточна стресна реакција |
| Не треба да се отстрануваат црвените крвни зрнца | Црвените крвни зрнца треба да се отстранат |
| Нуклеарните изразуваат биоинформации | Целата клетка изразува биоинформации |
Спецификации
| Примерок барања | Библиотека | Стратегија за секвенционирање | Препорачани податоци | Контрола на квалитет |
| Животинско ткиво ≥ 200 mg Растително ткиво ≥ 400 mg | 10x Genomics sn cDNA библиотека | Illumina PE150 | 100K PE читања по ќелија (100-200 Gb) | 700-1200 јадра/μl и интегритет на јадрата забележани под микроскоп |
За повеќе детали за упатствата за подготовка на примероци и работниот тек на услугата, слободно разговарајте со aексперт за BMKGENE
Тек на услужна работа
Ја вклучува следната анализа:
● Контрола на квалитет: број на клетки, детекција на гени, точна идентификација на клетките, молекули на РНК и квантификација на изразување
● Внатрешна анализа на примерокот:
Групирање ќелии и прибелешка на кластери
Анализа на диференцијални изрази: идентификација на DEG во кластери
Функционална прибелешка и збогатување на кластер DEG
● Анализа меѓу групите:
Комбинација на податоци
Анализа на диференцијални изрази: идентификација на DEG во групи
Функционална прибелешка и збогатување на групни DEG
● Напредна анализа:
Анализа на клеточниот циклус
Псевдовременска анализа
Анализа на мобилната комуникација (CellPhoneDB)
Анализа на збогатување на генски множества (GSEA)
Анализа на внатрешен примерок
Групирање на клетки:
Анализа на диференцијални изрази: кластер DEGs
Анализа меѓу групите
Анализа на диференцијални изрази: Групни DEG
Напредна анализа:
Псевдовременска анализа:
Анализа на клеточниот циклус:
Истражете го напредокот олеснет од услугите за секвенционирање на РНК со едно јадро на BMKGene од 10X Chromium во овие истакнати публикации:
Ванг, Л. и сор. (2021) 'Едноклеточната транскриптомска анализа го открива имунолошкиот пејзаж на белите дробови при егзацербација на астма отпорна на стероиди',Зборник на трудови на Националната академија на науките на Соединетите Американски Држави, 118 (2), стр. e2005590118. doi: 10.1073/pnas.2005590118
Женг, Х. и сор. (2022) „Глобална регулаторна мрежа за нерегулирана генска експресија и абнормална метаболичка сигнализација во имуните клетки во микросредината на болеста Грејвс и Хашимото тироидитис“,Граници во имунологијата, 13, стр. 879824. дои: 10.3389/FIMMU.2022.879824/BIBTEX.
Tian, H. et al. (2023) „Едноклеточниот транскриптом ја открива хетерогеноста и имунолошките одговори на леукоцитите по вакцинацијата со инактивирана Edwardsiella tarda кај флондер (Paralichthys olivaceus)“,Аквакултура, 566, стр. 739238. дои: 10.1016/Ј.АКВАКУЛТУРА.2023 година.739238.
Yu, Y. и сор. (2023) „Фотодинамичката терапија го подобрува исходот на инхибиторите на имунолошкиот контролен пункт преку ремоделирање на анти-туморскиот имунитет кај пациенти со рак на желудник“,Рак на желудник, 26 (5), стр. 798–813. doi: 10.1007/S10120-023-01409-X/METRICS.
