Vieno branduolio RNR sekos nustatymas
Techninė schema
Branduolius izoliuoja 10× Genomics Chromium™, susidedanti iš aštuonių kanalų mikroskysčių sistemos su dvigubomis kryžmėmis. Šioje sistemoje gelio rutuliukai su brūkšniniais kodais ir gruntu, fermentais ir vienu branduoliu yra kapsuliuojami į nanolitro dydžio aliejaus lašą, sukuriant gelio granules emulsijoje (GEM). Kai susidaro GEM, kiekviename GEM atliekama ląstelių lizė ir brūkšninių kodų išleidimas. mRNR yra atvirkštinis transkribavimas į cDNR molekules su 10 × brūkšniniais kodais ir UMI, kurioms toliau taikoma standartinė sekos bibliotekos konstrukcija.
Savybės
● Vieno branduolio suspensijos ruošimas iš šaldytų audinių
● Gel Bead-in-Emulsion (GEM) formavimas, po kurio vyksta cDNR sintezė
● Kiekviename GEM rutulyje yra pradmenų, sudarytų iš 4 sekcijų:
poli(dT) uodega, skirta mRNR pradžiai ir cDNR sintezei,
Unikalus molekulinis identifikatorius (UMI), skirtas ištaisyti stiprinimo paklaidą
10x brūkšninis kodas
Dalinio nuskaitymo 1 sekos nustatymo pradmenų surišimo seka
Privalumai
Vieno branduolio RNR sekos nustatymas apeina vienos ląstelės RNR sekos nustatymo apribojimus ir leidžia:
● Naudoti šaldytus mėginius, o ne tik šviežius
● Mažas sušaldytų ląstelių stresas, palyginti su šviežių ląstelių apdorojimu fermentiniu būdu, transkripto duomenyse atsispindi mažiau streso sukeltų genų pavidalu.
● Nereikia iš anksto pašalinti raudonųjų kraujo kūnelių
● Neribotas celių skersmuo
● Didelis mėginių rinkinys, tinkamas analizei, įskaitant sudėtingus ir trapius audinių tipus, kurie yra linkę į ląsteles sulipti arba sunaikinti audinių disociacijos metu.
Mėginiai, kurių negalima analizuoti taikant vienos ląstelės RNR sekos nustatymą ir tinkami vieno branduolio RNR sekos nustatymui:
| Ląstelė / audiniai | Priežastis |
| Nešvieži šaldyti audiniai | Nepavyko gauti naujų arba ilgai išsaugotų organizacijų |
| Raumenų ląstelė, megakariocitai, riebalai… | Ląstelės skersmuo per didelis, kad būtų galima patekti į instrumentą |
| Kepenys… | Per trapus, kad sulaužytų, negali atskirti pavienių ląstelių |
| Neuroninė ląstelė, smegenys… | Jautresnis, lengvai įtempiamas, pakeis sekos rezultatus |
| Kasa, skydliaukė… | Gausu endogeninių fermentų, turinčių įtakos vienos ląstelės suspensijos gamybai |
Vieno branduolio vs vienaląstė
| Vienabranduolis | Vienaląstė |
| Neribotas ląstelės skersmuo | Ląstelės skersmuo: 10-40 μm |
| Medžiaga gali būti užšaldytas audinys | Medžiaga turi būti šviežių audinių |
| Mažas šaldytų ląstelių stresas | Gydymas fermentais gali sukelti ląstelių streso reakciją |
| Nereikia pašalinti raudonųjų kraujo kūnelių | Raudonieji kraujo kūneliai turi būti pašalinti |
| Branduolinė išreiškia bioinformaciją | Visa ląstelė išreiškia bioinformaciją |
Specifikacijos
| Pavyzdiniai reikalavimai | biblioteka | Sekos nustatymo strategija | Rekomenduojami duomenys | Kokybės kontrolė |
| Gyvūninis audinys ≥ 200 mg Augalinis audinys ≥ 400 mg | 10x Genomics sn cDNR biblioteka | Illumina PE150 | 100 000 PE nuskaito viename langelyje (100–200 Gb) | 700-1200 branduolių/μl ir branduolių vientisumas stebimas mikroskopu |
Norėdami gauti daugiau informacijos apie pavyzdžių paruošimo gaires ir aptarnavimo darbo eigą, nedvejodami kreipkitės į aBMKGENE ekspertas
Aptarnavimo darbų eiga
Apima šią analizę:
● Kokybės kontrolė: ląstelių skaičius, genų aptikimas, tikslus ląstelių, RNR molekulių identifikavimas ir ekspresijos kiekybinis nustatymas
● Vidinio pavyzdžio analizė:
Ląstelių grupavimas ir klasterio anotacija
Diferencialinės išraiškos analizė: DEG identifikavimas klasteriuose
Klasterių DEG funkcinė anotacija ir praturtinimas
● Tarpgrupinė analizė:
Duomenų derinys
Diferencialinės išraiškos analizė: DEG identifikavimas grupėse
Funkcinė anotacija ir grupės DEG praturtinimas
● Išplėstinė analizė:
Ląstelių ciklo analizė
Pseudolaiko analizė
Mobiliojo ryšio analizė (CellPhoneDB)
Genų rinkinio praturtinimo analizė (GSEA)
Vidinės imties analizė
Ląstelių grupavimas:
Diferencialinės išraiškos analizė: klasteris DEG
Tarpgrupinė analizė
Diferencialinės raiškos analizė: grupė DEG
Išplėstinė analizė:
Pseudolaiko analizė:
Ląstelių ciklo analizė:
Ištirkite pažangą, kurią palengvino BMKGene vieno branduolio RNR sekos nustatymo paslaugos naudojant 10X Chromium šiuose publikacijose:
Wang, L. ir kt. (2021 m.) „Vienos ląstelių transkriptominė analizė atskleidžia plaučių imuninį kraštovaizdį steroidams atsparios astmos paūmėjimo atveju“,Jungtinių Amerikos Valstijų nacionalinės mokslų akademijos darbai, 118 (2), p. e2005590118. doi: 10.1073/pnas.2005590118
Zheng, H. ir kt. (2022) „Pasaulinis reguliavimo tinklas, skirtas sutrikusios genų ekspresijos ir nenormalių medžiagų apykaitos signalų teikimui imuninėse ląstelėse Graveso ligos ir Hashimoto tiroidito mikroaplinkoje“,Imunologijos ribos, 13, p. 879824. doi: 10.3389/FIMMU.2022.879824/BIBTEX.
Tian, H. ir kt. (2023) „Vienaląstelinis transkriptas atskleidžia leukocitų heterogeniškumą ir imuninį atsaką po vakcinacijos su inaktyvuota plekšnių Edwardsiella tarda (Paralichthys olivaceus)“Akvakultūra, 566, p. 739238. doi: 10.1016/J.AQUACULTURE.2023.739238.
Yu, Y. ir kt. (2023) „Fotodinaminė terapija pagerina imuninės kontrolės taško inhibitorių rezultatus, pertvarkydama priešnavikinį imunitetą pacientams, sergantiems skrandžio vėžiu“,Skrandžio vėžys, 26(5), p. 798–813. doi: 10.1007/S10120-023-01409-X/METRICS.
