PacBio 2+3 толық ұзындықтағы мРНҚ ерітіндісі
Ерекше өзгешеліктері
● Оқу дизайны:
Транскрипт изоформаларын анықтау үшін PacBio көмегімен жинақталған үлгі реттелген
Бөлек үлгілер (көшірмелер және сыналатын шарттар) реттелгенТранскрипт өрнегін сандық анықтау үшін NGS
● CCS режимінде PacBio реттілігі, HiFi оқуларын генерациялау
● Толық метражды транскрипттердің реттілігі
● Талдау анықтамалық геномды қажет етпейді; дегенмен, оны пайдалануға болады
● Биоинформатикалық талдау ген мен изоформа деңгейіндегі экспрессияны ғана емес, сонымен қатар lncRNA, гендердің синтезі, полиаденилденуі және ген құрылымының талдауын қамтиды.
Артықшылықтары
● Жоғары дәлдік: HiFi дәлдігі >99,9% (Q30) оқиды, NGS-пен салыстыруға болады
● Альтернативті қосу талдауы: барлық транскрипттерді секвенирлеу изоформаны анықтауға және сипаттауға мүмкіндік береді.
● PacBio және NGS күшті жақтарының комбинациясы: изоформа деңгейінде экспрессияны сандық анықтауға мүмкіндік береді, бүкіл ген экспрессиясын талдау кезінде жасырылуы мүмкін өзгерістерді ашады
● Кең тәжірибе: 1100-ден астам PacBio толық метражды транскриптомдық жобаларды аяқтау және 2300-ден астам үлгілерді өңдеу тәжірибесі бар біздің команда әрбір жобаға бай тәжірибе әкеледі.
● Сатудан кейінгі қолдау: біздің міндеттеме сатылымнан кейінгі 3 айлық қызмет көрсету мерзімімен жобаны аяқтағаннан кейін де кеңейеді. Осы уақыт ішінде біз нәтижелерге қатысты кез келген сұрауларды шешу үшін жобаны бақылауды, ақаулықтарды жою бойынша көмекті және сұрақ-жауап сессияларын ұсынамыз.
Үлгіге қойылатын талаптар және жеткізу
| Кітапхана | Тізбектеу стратегиясы | Деректер ұсынылады | Сапаны бақылау |
| PolyA байытылған мРНҚ CCS кітапханасы | PacBio жалғасы II PacBio Revio | 20/40 Гб 5/10 M CCS | Q30≥85% |
| Poly A байытылған | Illumina PE150 | 6-10 Гб | Q30≥85% |
Нуклеотидтер
|
| Конс.(нг/мкл) | Мөлшері (мкг) | Тазалық | Тұтастық |
| Illumina кітапханасы | ≥ 10 | ≥ 0,2 | OD260/280=1,7-2,5 OD260/230=0,5-2,5 Гельде ақуыз немесе ДНҚ ластануы шектеулі немесе жоқ. | Өсімдіктер үшін: RIN≥4,0; Жануарлар үшін: RIN≥4,5; 5,0≥28S/18S≥1,0; шектелген немесе жоқ бастапқы биіктік |
| PacBio кітапханасы | ≥ 100 | ≥ 1,0 | OD260/280=1,7-2,5 OD260/230=0,5-2,5 Гельде ақуыз немесе ДНҚ ластануы шектеулі немесе жоқ. | Өсімдіктер: RIN≥7,5 Жануарлар: RIN≥8,0 5,0≥28S/18S≥1,0; шектелген немесе жоқ бастапқы биіктік |
Ұсынылатын үлгіні жеткізу
Контейнер: 2 мл центрифуга түтігі (қаңылтыр фольга ұсынылмайды)
Үлгі таңбалау: Топ+қайталау, мысалы, A1, A2, A3; B1, B2, B3.
жөнелту:
1. Құрғақ мұз:Үлгілерді қаптарға салып, құрғақ мұзға көму керек.
2. РНҚ тұрақты түтіктер: РНҚ үлгілерін РНҚ тұрақтандыру түтігінде (мысалы, RNAstable®) кептіруге және бөлме температурасында жөнелтуге болады.
Келесі талдауды қамтиды:
Шикі деректер сапасын бақылау
Баламалы полиаденилдену талдауы (APA)
Фьюжн транскрипциясын талдау
Альтернативті сплайсинг талдауы
Universal Single-Copy Orthologs (BUSCO) салыстыру талдауы
Жаңа транскрипттік талдау: кодтау ретін болжау (CDS) және функционалдық аннотация
lncRNA талдауы: lncRNA және нысандарды болжау
MicroSatelite идентификациясы (SSR)
Дифференциалды экспрессиялық транскрипттерді (DETs) талдау
Дифференциалды экспрессиялық гендер (DEGs) талдауы
DEG және DET-тің функционалдық аннотациясы
BUSCO талдауы
Альтернативті сплайсинг талдауы
Баламалы полиаденилдену талдауы (APA)
Дифференциалды экспрессияланған гендер (DEGs) және транскрипттер (DETs9 талдау
DET және DEG-тің ақуыз-белок әрекеттесу желілері
BMKGene компаниясының PacBio 2+3 толық ұзындықтағы мРНҚ секвенирлеуімен қамтамасыз етілген жетістіктерді зерттеген басылымдар жинағы арқылы зерттеңіз.
Чао, Q. және т.б. (2019) 'Populus дің транскриптомының даму динамикасы', Өсімдік биотехнологиясы журналы, 17(1), 206–219 беттер. doi: 10.1111/PBI.12958.
Deng, H. et al. (2022) «Актинидия latifolia (аскорбатқа бай жеміс дақылы) жемісінің дамуы және пісуі кезіндегі аскорбин қышқылының құрамындағы динамикалық өзгерістер және байланысты молекулалық механизмдер', Молекулалық ғылымдардың халықаралық журналы, 23(10), б. 5808. doi: 10.3390/IJMS23105808/S1.
Хуа, X. және т.б. (2022) «Париж полифилласындағы биоактивті полифиллиндерге қатысатын биосинтетикалық жол гендерінің тиімді болжамы», Коммуникациялар биологиясы 2022 5:1, 5(1), 1-10 беттер. doi: 10.1038/s42003-022-03000-z.
Лю, М. және т.б. (2023) 'Tuta absoluta (Meyrick) транскриптомы және цитохром P450 гендерінің біріктірілген PacBio Iso-Seq және Illumina RNA-Seq талдауы', Жәндіктер, 14(4), б. 363. doi: 10.3390/INSECTS14040363/S1.
Ван, Лицзюн және т.б. (2019) 'Ricinus communis-те рицинол қышқылы биосинтезін жақсырақ түсіну үшін Illumina РНҚ реттілігімен біріктірілген PacBio бір молекулалы нақты уақыттағы талдауды қолдану арқылы транскриптом күрделілігіне шолу', BMC Genomics, 20(1), 1-17 беттер. doi: 10.1186/S12864-019-5832-9/FIGURES/7.
