Sequenziamento dell'RNA singoli
Schema tecnico
L'isolamento dei nuclei è ottenuto da 10 × Genomics Chromium ™, che consiste un sistema di microfluidica a otto canali con doppi incroci. In questo sistema, un gel perline con codici a barre e primer, gli enzimi e un singolo nucleo sono incapsulati nella goccia di petrolio di dimensioni nanolitri, generando tallone in gel-in-emulsione (GEM). Una volta formati GEM, la lisi cellulare e il rilascio di codici a barre vengono eseguiti in ogni gemma. L'mRNA è trascritto inverso in molecole di cDNA con 10 × codici a barre e UMI, che sono ulteriormente soggetti alla costruzione della libreria di sequenziamento standard.
Caratteristiche
● Preparazione della sospensione a singolo nuclei dai tessuti congelati
● Formazione di gel perline-in-emulsione (GEM) seguita dalla sintesi di cDNA
● Ogni tallone in una gemma viene caricato con primer composti da 4 sezioni:
coda poli (dt) per innesco di mRNA e sintesi di cDNA,
Identificatore molecolare unico (UMI) per correggere la distorsione dell'amplificazione
10 volte codice a barre
Sequenza di legame del primer di sequenziamento di lettura 1 parziale
Vantaggi
Il sequenziamento dell'RNA a singolo nucleo elude i limiti del sequenziamento dell'RNA a cellula singola, abilitando:
● l'uso di campioni congelati e non solo limitato a campioni freschi
● basso stress delle cellule congelate rispetto al trattamento enzimatico delle cellule fresche, riflettete nei dati del trascrittoma sotto forma di geni meno indotti dallo stress
● Non è necessaria la rimozione preventiva dei globuli rossi
● Diametro cellulare illimitato
● Grande gamma di campioni ammissibili all'analisi, inclusi tipi di tessuto complessi e fragili che sono soggetti a raggruppamento o distruzione cellulare durante la dissociazione dei tessuti
Campioni che non possono essere analizzati mediante sequenziamento dell'RNA a cellula singola e sono ammissibili al sequenziamento dell'RNA a singolo nuclei:
| Cellula / tessuto | Motivo |
| Tessuto congelato Unfresh | Incapace di ottenere organizzazioni fresche o salvate |
| Cellule muscolari, megacariociti, grasso ... | Il diametro cellulare è troppo grande per entrare nello strumento |
| Fegato… | Troppo fragile per rompere, incapace di distinguere singole cellule |
| Cellula neurone, cervello ... | Più sensibile, facile da stress, cambierà i risultati del sequenziamento |
| Pancreas, tiroide ... | Ricco di enzimi endogeni, che influenzano la produzione di sospensione a singola cellula |
Single-nucleo vs single-cell
| Single-nucleo | Single-cell |
| Diametro cellulare illimitato | Diametro cellulare: 10-40 μm |
| Il materiale può essere congelato tessuto | Il materiale deve essere tessuto fresco |
| Basso stress delle cellule congelate | Il trattamento enzimatico può causare una reazione di stress cellulare |
| Non è necessario rimuovere i globuli rossi | I globuli rossi devono essere rimossi |
| Il nucleare esprime bioinformazione | L'intera cellula esprime la bioinformazione |
Specifiche
| Requisiti del campione | Biblioteca | Strategia di sequenziamento | Dati consigliati | Controllo di qualità |
| Tessuto animale ≥ 200 mg Tessuto vegetale ≥ 400 mg | 10x Genomics SN CDNA Library | Illumina PE150 | 100k PE legge per cella (100-200 GB) | 700-1200 nuclei/μL e integrità dei nuclei osservati al microscopio |
Per maggiori dettagli sulla guida alla preparazione del campione e sul flusso di lavoro di servizio, non esitare a parlare con unEsperto di bmkgene
Flusso di lavoro di servizio
Include la seguente analisi:
● Controllo di qualità: numero di cellule, rilevamento geni, identificazione accurata di cellule, molecole di RNA e quantificazione dell'espressione
● Analisi del campione interno:
Clustering di celle e annotazione del cluster
Analisi dell'espressione differenziale: identificazione dei DEG nei cluster
Annotazione funzionale e arricchimento di gradi gradi
● Analisi tra gruppi:
Combinazione di dati
Analisi dell'espressione differenziale: identificazione dei DEG in gruppi
Annotazione funzionale e arricchimento di DEG di gruppo
● Analisi avanzata:
Analisi del ciclo cellulare
Analisi pseudotime
Analisi delle comunicazioni cellulari (cellulare PhonedB)
Analisi di arricchimento del set genico (GSEA)
Analisi del campione interno
Clustering di celle:
Analisi dell'espressione differenziale: gradi cluster
Analisi tra gruppi
Analisi dell'espressione differenziale: DEG di gruppo
Analisi avanzata:
Analisi pseudotime:
Analisi del ciclo cellulare:
Esplora i progressi facilitati dai servizi di sequenziamento dell'RNA a nucleo singolo di BMKGENE mediante Chromium 10x in queste pubblicazioni in primo piano:
Wang, L. et al. (2021) "L'analisi trascrittomica a cella singola rivela il paesaggio immunitario del polmone nell'esacerbazione dell'asma resistente agli steroidi",Atti della National Academy of Sciences degli Stati Uniti d'America, 118 (2), p. E2005590118. doi: 10.1073/pnas.2005590118
Zheng, H. et al. (2022) "Una rete regolatoria globale per l'espressione genica disregolata e la segnalazione metabolica anormale nelle cellule immunitarie nel microambiente della malattia delle tombe e la tiroidite di Hashimoto",Frontiers in Immunology, 13, p. 879824. Doi: 10.3389/fimmu.2022.879824/bibtex.
Tian, H. et al. (2023) "Il trascrittoma a cellula singola scopre l'eterogeneità e le risposte immunitarie dei leucociti dopo la vaccinazione con EDWARSIELLA TARDA inattivata in Flounder (Paralichthys olivaceus)",Acquacoltura, 566, p. 739238. Doi: 10.1016/j.aquaculture.2023.739238.
Yu, Y. et al. (2023) "La terapia fotodinamica migliora l'esito degli inibitori del checkpoint immunitario attraverso il rimodellamento dell'immunità anti-tumoraggio nei pazienti con carcinoma gastrico",Cancro gastrico, 26 (5), pagg. 798–813. doi: 10.1007/s10120-023-01409-x/metriche.
