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Analisi di associazione su tutto il genoma
Lo scopo dei Genome-Wide Association Studies (GWAS) è quello di identificare varianti genetiche (genotipi) legate a tratti specifici (fenotipi). Esaminando i marcatori genetici dell'intero genoma in un gran numero di individui, GWAS estrapola le associazioni genotipo-fenotipo attraverso analisi statistiche a livello di popolazione. Questa metodologia trova ampie applicazioni nella ricerca sulle malattie umane e nell'esplorazione dei geni funzionali correlati a tratti complessi negli animali o nelle piante.
Presso BMKGENE, offriamo due strade per condurre GWAS su grandi popolazioni: impiegando il sequenziamento del genoma intero (WGS) o optando per un metodo di sequenziamento del genoma a rappresentazione ridotta, il frammento amplificato del locus specifico (SLAF) sviluppato internamente. Mentre il WGS si adatta a genomi più piccoli, SLAF emerge come un’alternativa economicamente vantaggiosa per studiare popolazioni più grandi con genomi più lunghi, riducendo efficacemente al minimo i costi di sequenziamento e garantendo al tempo stesso un’elevata efficienza nella scoperta di marcatori genetici.
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Sequenziamento dell'RNA a nucleo singolo
Lo sviluppo di tecniche di cattura di singole cellule e di costruzione di librerie personalizzate, abbinato al sequenziamento ad alto rendimento, ha rivoluzionato gli studi sull'espressione genica a livello cellulare. Questa svolta consente un’analisi più approfondita e completa di popolazioni cellulari complesse, superando i limiti associati alla media dell’espressione genica su tutte le cellule e preservando la vera eterogeneità all’interno di queste popolazioni. Sebbene il sequenziamento dell'RNA a cellula singola (scRNA-seq) presenti innegabili vantaggi, incontra sfide in alcuni tessuti in cui la creazione di una sospensione unicellulare si rivela difficile e richiede campioni freschi. Noi di BMKGene affrontiamo questo ostacolo offrendo il sequenziamento dell'RNA a nucleo singolo (snRNA-seq) utilizzando la tecnologia all'avanguardia 10X Genomics Chromium. Questo approccio amplia lo spettro di campioni suscettibili di analisi del trascrittoma a livello di singola cellula.
L'isolamento dei nuclei avviene tramite l'innovativo chip 10X Genomics Chromium, caratterizzato da un sistema microfluidico a otto canali con doppi incroci. All'interno di questo sistema, le perle di gel che incorporano codici a barre, primer, enzimi e un singolo nucleo sono incapsulate in gocce di olio delle dimensioni di un nanolitro, formando Gel Bead-in-Emulsion (GEM). Dopo la formazione del GEM, all'interno di ciascun GEM si verificano la lisi cellulare e il rilascio del codice a barre. Successivamente, le molecole di mRNA subiscono la trascrizione inversa in cDNA, incorporando codici a barre 10X e identificatori molecolari univoci (UMI). Questi cDNA vengono quindi sottoposti alla costruzione di librerie di sequenziamento standard, facilitando un'esplorazione approfondita e completa dei profili di espressione genica a livello di singola cellula.
Piattaforma: 10× Genomics Chromium e piattaforma Illumina NovaSeq
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Sequenziamento dell'intero genoma di piante/animali
Il sequenziamento dell'intero genoma (WGS), noto anche come risequenziamento, si riferisce al sequenziamento dell'intero genoma di diversi individui di specie con genomi di riferimento noti. Su questa base è possibile identificare ulteriormente le differenze genomiche di individui o popolazioni. WGS consente l'identificazione del polimorfismo a singolo nucleotide (SNP), della delezione di inserzione (InDel), della variazione della struttura (SV) e della variazione del numero di copie (CNV). Gli SV comprendono una porzione maggiore della base di variazione rispetto agli SNP e hanno un impatto maggiore sul genoma, influenzando sostanzialmente gli organismi viventi. Mentre il risequenziamento a lettura breve è efficace nell'identificare SNP e InDel, il risequenziamento a lettura lunga consente un'identificazione più precisa di frammenti di grandi dimensioni e variazioni complicate.
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10x trascrittoma spaziale Genomics Visium
La trascrittomica spaziale è una tecnologia all’avanguardia che consente ai ricercatori di studiare i modelli di espressione genetica all’interno dei tessuti preservandone il contesto spaziale. Una potente piattaforma in questo ambito è 10x Genomics Visium abbinato al sequenziamento Illumina. Il principio di 10X Visium si basa su un chip specializzato con un'area di cattura designata in cui vengono posizionate le sezioni di tessuto. Quest'area di cattura contiene punti con codice a barre, ciascuno corrispondente a una posizione spaziale unica all'interno del tessuto. Le molecole di RNA catturate dal tessuto vengono quindi etichettate con identificatori molecolari univoci (UMI) durante il processo di trascrizione inversa. Questi punti con codice a barre e UMI consentono una mappatura spaziale precisa e una quantificazione dell'espressione genica con una risoluzione di singola cellula. La combinazione di campioni con codici a barre spaziali e UMI garantisce l'accuratezza e la specificità dei dati generati. Utilizzando questa tecnologia di trascrittomica spaziale, i ricercatori possono acquisire una comprensione più profonda dell'organizzazione spaziale delle cellule e delle complesse interazioni molecolari che si verificano all'interno dei tessuti, offrendo informazioni preziose sui meccanismi alla base dei processi biologici in molteplici campi, tra cui oncologia, neuroscienze, biologia dello sviluppo, immunologia. e studi botanici.
Piattaforma: 10X Genomics Visium e Illumina NovaSeq
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Nanoporo per sequenziamento dell'mRNA a lunghezza intera
Sebbene il sequenziamento dell'mRNA basato su NGS sia uno strumento versatile per quantificare l'espressione genica, la sua dipendenza da letture brevi ne limita l'efficacia nelle analisi trascrittomiche complesse. D'altra parte, il sequenziamento dei nanopori utilizza la tecnologia a lettura lunga, consentendo il sequenziamento di trascrizioni di mRNA a lunghezza intera. Questo approccio facilita un'esplorazione completa dello splicing alternativo, delle fusioni geniche, della poliadenilazione e della quantificazione delle isoforme di mRNA.
Il sequenziamento dei nanopori, un metodo che si basa su segnali elettrici in tempo reale di singole molecole di nanopori, fornisce risultati in tempo reale. Guidato dalle proteine motrici, il DNA a doppio filamento si lega alle proteine dei nanopori incorporati in un biofilm, svolgendosi mentre passa attraverso il canale dei nanopori sotto una differenza di voltaggio. I segnali elettrici distintivi generati dalle diverse basi sul filamento del DNA vengono rilevati e classificati in tempo reale, facilitando il sequenziamento nucleotidico accurato e continuo. Questo approccio innovativo supera i limiti di breve lettura e fornisce una piattaforma dinamica per complesse analisi genomiche, compresi complessi studi trascrittomici, con risultati immediati.
Piattaforma: Nanopore PromethION 48
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Sequenziamento dell'mRNA a lunghezza intera -PacBio
Sebbene il sequenziamento dell'mRNA basato su NGS sia uno strumento versatile per quantificare l'espressione genica, la sua dipendenza da letture brevi ne limita l'uso in analisi trascrittomiche complesse. D'altra parte, il sequenziamento PacBio (Iso-Seq) utilizza la tecnologia a lettura lunga, consentendo il sequenziamento delle trascrizioni di mRNA a lunghezza intera. Questo approccio facilita un'esplorazione completa dello splicing alternativo, delle fusioni geniche e della poliadenilazione. Tuttavia, ci sono altre scelte per la quantificazione dell'espressione genica a causa dell'elevata quantità di dati richiesti. La tecnologia di sequenziamento PacBio si basa sul sequenziamento di singole molecole in tempo reale (SMRT), fornendo un netto vantaggio nell'acquisizione di trascrizioni di mRNA a lunghezza intera. Questo approccio innovativo prevede l'utilizzo di guide d'onda in modalità zero (ZMW) e pozzetti microfabbricati che consentono l'osservazione in tempo reale dell'attività della DNA polimerasi durante il sequenziamento. All'interno di questi ZMW, la DNA polimerasi di PacBio sintetizza un filamento complementare di DNA, generando lunghe letture che coprono l'intera trascrizione dell'mRNA. Il funzionamento di PacBio in modalità Circular Consensus sequencing (CCS) migliora la precisione sequenziando ripetutamente la stessa molecola. Le letture HiFi generate hanno un'accuratezza paragonabile a quella NGS, contribuendo ulteriormente a un'analisi completa e affidabile di complesse caratteristiche trascrittomiche.
Piattaforma: PacBio Sequel II; PacBio Revio
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Sequenziamento dell'mRNA eucariotico-NGS
Il sequenziamento dell'mRNA, una tecnologia versatile, consente la profilazione completa di tutte le trascrizioni dell'mRNA all'interno delle cellule in condizioni specifiche. Con le sue applicazioni ad ampio raggio, questo strumento all’avanguardia svela intricati profili di espressione genetica, strutture genetiche e meccanismi molecolari associati a diversi processi biologici. Ampiamente adottato nella ricerca fondamentale, nella diagnostica clinica e nello sviluppo di farmaci, il sequenziamento dell'mRNA offre approfondimenti sulle complessità della dinamica cellulare e della regolazione genetica, suscitando curiosità sul suo potenziale in vari campi.
Piattaforma: Illumina NovaSeq X; DNBSEQ-T7
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Sequenziamento di mRNA-NGS non basato su riferimento
Il sequenziamento dell'mRNA consente la profilazione completa di tutte le trascrizioni dell'mRNA all'interno delle cellule in condizioni specifiche. Questa tecnologia all’avanguardia funge da potente strumento, svelando intricati profili di espressione genetica, strutture genetiche e meccanismi molecolari associati a diversi processi biologici. Ampiamente adottato nella ricerca fondamentale, nella diagnostica clinica e nello sviluppo di farmaci, il sequenziamento dell'mRNA offre approfondimenti sulle complessità della dinamica cellulare e della regolazione genetica.
Piattaforma: Illumina NovaSeq X; DNBSEQ-T7
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Sequenziamento lungo non codificante-Illumina
Gli RNA lunghi non codificanti (lncRNA) sono più lunghi di 200 nucleotidi che possiedono un potenziale di codifica minimo e sono elementi cruciali all'interno dell'RNA non codificante. Presenti nel nucleo e nel citoplasma, questi RNA svolgono un ruolo cruciale nella regolazione epigenetica, trascrizionale e post-trascrizionale, sottolineando il loro significato nel modellare i processi cellulari e molecolari. Il sequenziamento dell'LncRNA è un potente strumento nella differenziazione cellulare, nell'ontogenesi e nelle malattie umane.
Piattaforma: Illumina NovaSeq
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Sequenziamento di piccoli RNA-Illumina
Le molecole di piccoli RNA (sRNA), includono microRNA (miRNA), piccoli RNA interferenti (siRNA) e RNA che interagiscono con piwi (piRNA). Tra questi, i miRNA, lunghi circa 18-25 nucleotidi, sono particolarmente degni di nota per il loro ruolo regolatorio fondamentale in vari processi cellulari. Con modelli di espressione specifici del tessuto e dello stadio, i miRNA mostrano un'elevata conservazione tra specie diverse.
Piattaforma: Illumina NovaSeq
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CircRNA Sequenziamento-Illumina
Il sequenziamento dell'RNA circolare (circRNA-seq) consiste nel profilare e analizzare gli RNA circolari, una classe di molecole di RNA che formano anelli chiusi a causa di eventi di splicing non canonici, fornendo a questo RNA una maggiore stabilità. Mentre è stato dimostrato che alcuni circRNA agiscono come spugne di microRNA, sequestrando i microRNA e impedendo loro di regolare i loro mRNA bersaglio, altri circRNA possono interagire con le proteine, modulare l'espressione genica o avere ruoli nei processi cellulari. L’analisi dell’espressione del circRNA fornisce approfondimenti sui ruoli regolatori di queste molecole e sul loro significato in vari processi cellulari, stadi di sviluppo e condizioni di malattia, contribuendo a una comprensione più profonda della complessità della regolazione dell’RNA nel contesto dell’espressione genica.
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Sequenziamento dell'intero trascrittoma – Illumina
Il sequenziamento dell'intero trascrittoma offre un approccio completo alla profilazione di diverse molecole di RNA, comprendendo RNA codificanti (mRNA) e non codificanti (lncRNA, circRNA e miRNA). Questa tecnica cattura l'intero trascrittoma di cellule specifiche in un dato momento, consentendo una comprensione olistica dei processi cellulari. Conosciuto anche come “sequenziamento totale dell’RNA”, mira a svelare intricate reti regolatorie a livello del trascrittoma, consentendo analisi approfondite come l’RNA endogeno competitivo (ceRNA) e l’analisi congiunta dell’RNA. Ciò segna il passo iniziale verso la caratterizzazione funzionale, in particolare nello svelare le reti regolatorie che coinvolgono le interazioni ceRNA basate su circRNA-miRNA-mRNA.
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Sequenziamento dell'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP-seq)
L'immunoprecipitazione della cromatina (CHIP) è una tecnica che sfrutta gli anticorpi per arricchire selettivamente le proteine leganti il DNA e i loro corrispondenti bersagli genomici. La sua integrazione con NGS consente la profilazione dell'intero genoma di target del DNA associati alla modificazione degli istoni, ai fattori di trascrizione e ad altre proteine che legano il DNA. Questo approccio dinamico consente il confronto dei siti di legame tra diversi tipi di cellule, tessuti o condizioni. Le applicazioni di ChIP-Seq spaziano dallo studio della regolazione trascrizionale e dei percorsi di sviluppo alla spiegazione dei meccanismi della malattia, rendendolo uno strumento indispensabile per comprendere i paesaggi di regolazione genomica e far avanzare intuizioni terapeutiche.
Piattaforma: Illumina NovaSeq
