Seluruh genome resequening
Pemantauan Genomik SARS-COV-2 mengungkap varian penghapusan NSP1 yang memodulasi respons interferon tipe I
Nanopore | Illumina | Seluruh genom resequencing | Metagenomik | RNA-seq | Sanger
Biomarker Technologies memberikan dukungan teknis pada sekuensing sampel dalam penelitian ini.
Highlight
1.sars-cov-2 Sequencing dan analisis filognetik mengidentifikasi 35 mutasi berulang termasuk 31 SNP dan 4 indels.
2.sosiasi dengan 117 fenotipe klinis mengungkapkan berpotensi
mutasi penting.
∆500-532 di wilayah pengkodean NSP1 berkorelasi dengan virus yang lebih rendah
3.Load dan serum IFN-β.
4. Isolat viral dengan mutasi ∆500-532 menginduksi IFN-I yang lebih rendah
respons dalam sel yang terinfeksi.
Desain Eksperimental
Pencapaian
1. Pengawasan Epidemiologis dan Genomik
Data klinis dikumpulkan di provinsi Sichuan, Cina melintasi periode wabah dari 22 Januari 2020 hingga 20 Februari 2020. Sebanyak 538 kasus Covid-19 dikonfirmasi oleh tes qPCR di Sichuan, 28,8% di antaranya berasal dari provinsi tersebut modal. Kasus yang dikonfirmasi di Sichuan meningkat secara eksponensial, memuncak pada 30 Januari. Juga, data mendukung bahwa jarak sosial dapat menjadi faktor kunci dalam mencegah penyebaran virus.
Gambar 1. Studi Epidemiologis Covid-19 di Provinsi Sichuan, Cina
2. Konstruksi genom SARS-COV-2 dan identifikasi varian
Dengan amplifikasi PCR multipleks diikuti oleh sekuensing nanopore, total 310 genom lengkap-dekat atau parsial dari 248 pasien dihasilkan dengan kira-kira. 80% genom yang dicakup oleh 10 bacaan (kedalaman rata -rata: 0,39 m pembacaan per sampel).
Gambar 2. Frekuensi setiap varian dalam kelompok Sichuan
Sebanyak 104 SNP dan 18 indel diidentifikasi dari genom SARS-COV-2, di mana 31 SNP dan 4 indel diidentifikasi sebagai varian genetik berulang. Dengan membandingkannya dengan 169 sampel dari Wuhan dan dengan 81.391 urutan genom publik berkualitas tinggi di GISAID, 29 dari 35 varian yang ditemukan disajikan di benua lain. Khususnya, empat varian termasuk ∆500-532, ACC18108At, ∆729-737 dan T13243C, hanya ditemukan hadir di Sichuan dan Wuhan dan tidak ada dalam data GISAID, menunjukkan bahwa varian ini sangat mungkin terkesan dari Wuhan, yang bertemu dengan The The The the The The the the the the the Catatan perjalanan pasien.
Analisis evolusi dengan metode maksimum kemungkinan (ML) dan pendekatan jam molekuler Bayesian diproses pada 88 virus baru Sfrom Sichuan dan 250 genom dikuratori dari daerah lain. Genom dengan ∆500-532 (penghapusan di wilayah pengkodean NSP1) ditemukan didistribusikan jarang di pohon filogenetik. Analisis haplotype pada varian NSP1 mengidentifikasi 5 dari mereka dari beberapa kota. Hasil ini menunjukkan bahwa ∆500-532 terjadi di banyak kota dan mungkin diimpor beberapa kali dari Wuhan.
Gambar 2. Varian genetik berulang dan analisis filogenetik dalam genom SARS-COV-2
3. Asosiasi varian genetik berulang dengan implikasi klinis
117 fenotipe klinis dikaitkan dengan keparahan COVID-19, di mana 19 fenotip yang berhubungan dengan keparahan diklasifikasikan menjadi sifat-sifat parah dan tidak berat. Hubungan antara ciri-ciri ini dan 35 varian genetik berulang diabaikan dalam heatmap bi-cluster. Analisis pengayaan peringkat seperti GSEA menunjukkan bahwa ∆500-532 berkorelasi negatif dengan ESR, serum IFN-β dan CD3+ CD8+ sel T dalam darah. Selain itu, tes qPCR menunjukkan bahwa pasien yang terinfeksi virus yang menyimpan ∆500-532 memiliki nilai CT tertinggi, yaitu viral load terendah.
Gambar 3. Asosiasi 35 varian genetik berulang dengan fenotipe klinis
4. Validasi pada mutasi virus terkait fenotipe klinis
Untuk memahami pengaruh ∆500-532 pada fungsi NSP1, sel HEK239T ditransfeksi dengan plasmid yang mengekspresikan bentuk full-length, WT NSP1 dan mutan dengan penghapusan. Profil transkriptome dari masing -masing sel HEK239T yang dirawat diproses untuk analisis PCA, menunjukkan bahwa mutan penghapusan berkerumun relatif lebih dekat dan secara signifikan berbeda dari WT NSP1. Gen -gen yang secara signifikan diregulasi dalam mutan terutama diperkaya dalam "proses biosintesis/metabolisme peptida", "biogenesis kompleks ribonukleoprotein", "penargetan protein ke membran/ER", dll. Selain itu, dua penghapusan menunjukkan pola perluasan yang berbeda dari WT.
Gambar 4. Analisis transkriptom pada sel HEK239T ditransfeksi oleh WT NSP1 dan dengan penghapusan
Pengaruh penghapusan pada respons IFN-1 juga diuji dalam studi yang diekspresikan secara berlebihan. Semua penghapusan yang diuji ditunjukkan untuk mengurangi IFN-1 repsonse dalam sel HEK239T dan A549 yang ditransfeksi pada tingkat transkriptom dan tingkat protein. Menariknya, gen yang diatur secara signifikan dalam penghapusan diperkaya dalam "respons pertahanan terhadap virus", "replikasi genom virus", "regulasi transkripsi oleh RNA polimerase II" dan "respons terhadap interferon tipe I".
Gambar 5. Down Regulasi jalur pensinyalan interferon di mutan ∆500-532
Dalam penelitian ini, dampak penghapusan ini pada virus dikonfirmasi lebih lanjut oleh studi infeksi virus. Virus dengan mutan tertentu diisolasi dari sampel klinis dan terinfeksi ke sel Calu-3. Hasil terperinci pada studi infeksi virus dapat dibaca dalam makalah.
doi:10.1016/j.chom.2021.01.015
Referensi
Lin J, Tang C, Wei H, dkk. Pemantauan genomik SARS-COV-2 mengungkap varian penghapusan NSP1 yang memodulasi respons interferon tipe I [J]. Host & Microbe Sel, 2021.
Berita dan Sorotan Bertujuan untuk berbagi kasus -kasus sukses terbaru dengan teknologi biomarker, menangkap pencapaian ilmiah baru serta teknik -teknik terkemuka yang diterapkan selama penelitian.
Waktu posting: Jan-06-2022