-
Միակ միջուկների ՌՆԹ-ի հաջորդականություն
Մեկ բջիջների գրավման և անհատական գրադարանների կառուցման տեխնիկայի զարգացումը, զուգորդված բարձր թողունակության հաջորդականության հետ, հեղափոխություն է կատարել գեների արտահայտման ուսումնասիրությունների վրա բջջի մակարդակում: Այս բեկումը թույլ է տալիս ավելի խորը և համապարփակ վերլուծել բարդ բջիջների պոպուլյացիաները՝ հաղթահարելով բոլոր բջիջների վրա գենային արտահայտման միջինացման հետ կապված սահմանափակումները և պահպանելով իրական տարասեռությունը այդ պոպուլյացիաների ներսում: Թեև միաբջիջ ՌՆԹ-ի հաջորդականությունը (scRNA-seq) ունի անհերքելի առավելություններ, այն բախվում է որոշակի հյուսվածքների մարտահրավերների, որտեղ միաբջիջ կախույթի ստեղծումը դժվար է և պահանջում է թարմ նմուշներ: BMKGene-ում մենք լուծում ենք այս խոչընդոտը՝ առաջարկելով մեկ միջուկային ՌՆԹ-ի հաջորդականություն (snRNA-seq)՝ օգտագործելով ժամանակակից 10X Genomics Chromium տեխնոլոգիան: Այս մոտեցումը ընդլայնում է նմուշների սպեկտրը, որոնք ենթակա են տրանսկրիպտոմային վերլուծության միաբջիջ մակարդակում:
Միջուկների մեկուսացումն իրականացվում է նորարարական 10X Genomics Chromium չիպի միջոցով, որն ունի ութ ալիք միկրոհեղուկային համակարգ՝ կրկնակի խաչմերուկներով: Այս համակարգի շրջանակներում գելային ուլունքները, որոնք ներառում են շտրիխ կոդեր, պրայմերներ, ֆերմենտներ և մեկ միջուկ, պարփակվում են նանոլիտրի չափի յուղի կաթիլների մեջ՝ ձևավորելով Gel Bead-in-Emulsion (GEM): GEM-ի ձևավորումից հետո յուրաքանչյուր GEM-ում տեղի է ունենում բջիջների լիզում և շտրիխ կոդի թողարկում: Այնուհետև, mRNA մոլեկուլները ենթարկվում են հակադարձ տրանսկրիպցիայի cDNA-ների՝ ներառելով 10X շտրիխ կոդեր և եզակի մոլեկուլային նույնացուցիչներ (UMIs): Այս cDNA-ները այնուհետև ենթարկվում են ստանդարտ հաջորդականության գրադարանի կառուցմանը, ինչը հեշտացնում է գեների արտահայտման պրոֆիլների ամուր և համապարփակ ուսումնասիրությունը մեկ բջջային մակարդակում:
Պլատֆորմ՝ 10× Genomics Chromium և Illumina NovaSeq հարթակ
-
10x Genomics Visium Spatial Transcriptome
Տարածական տրանսկրիպտոմիկան նորագույն տեխնոլոգիա է, որը թույլ է տալիս հետազոտողներին ուսումնասիրել գեների արտահայտման ձևերը հյուսվածքներում՝ պահպանելով դրանց տարածական համատեքստը: Այս տիրույթում հզոր հարթակներից մեկը 10x Genomics Visium-ն է՝ զուգորդված Illumina հաջորդականությամբ: 10X Visium-ի սկզբունքը ընկած է մասնագիտացված չիպի վրա՝ հատուկ գրավման տարածքով, որտեղ տեղադրվում են հյուսվածքների հատվածները: Այս գրավման տարածքը պարունակում է շտրիխ կոդավորված բծեր, որոնցից յուրաքանչյուրը համապատասխանում է հյուսվածքի ներսում եզակի տարածական դիրքին: Հյուսվածքից գրավված ՌՆԹ մոլեկուլները այնուհետև պիտակավորվում են եզակի մոլեկուլային նույնացուցիչներով (UMIs) հակադարձ տառադարձման գործընթացում: Այս շտրիխ կոդավորված բծերը և UMI-ները հնարավորություն են տալիս ճշգրիտ տարածական քարտեզագրում և գեների արտահայտման քանակականացում մեկ բջջի լուծաչափով: Տարածական շտրիխ կոդավորված նմուշների և UMI-ների համադրությունն ապահովում է ստեղծվող տվյալների ճշգրտությունն ու առանձնահատկությունը: Օգտագործելով այս Spatial Transcriptomics տեխնոլոգիան՝ հետազոտողները կարող են ավելի խորը պատկերացում կազմել բջիջների տարածական կազմակերպման և հյուսվածքների ներսում տեղի ունեցող բարդ մոլեկուլային փոխազդեցությունների մասին՝ առաջարկելով անգնահատելի պատկերացումներ բազմաթիվ ոլորտներում կենսաբանական գործընթացների հիմքում ընկած մեխանիզմների մասին՝ ներառյալ ուռուցքաբանությունը, նյարդաբանությունը, զարգացման կենսաբանությունը, իմունոլոգիան: , և բուսաբանական ուսումնասիրություններ։
Պլատֆորմ՝ 10X Genomics Visium և Illumina NovaSeq
-
Ամբողջ երկարությամբ mRNA հաջորդականություն-Նանոպոր
Թեև NGS-ի վրա հիմնված mRNA հաջորդականությունը բազմակողմանի գործիք է գեների արտահայտման քանակականացման համար, դրա կախվածությունը կարճ ընթերցումների վրա սահմանափակում է դրա արդյունավետությունը բարդ տրանսկրիպտոմիական անալիզներում: Մյուս կողմից, նանոպորների հաջորդականությունը օգտագործում է երկար կարդացվող տեխնոլոգիա՝ հնարավորություն տալով ամբողջական երկարությամբ mRNA տառադարձումների հաջորդականությունը: Այս մոտեցումը նպաստում է այլընտրանքային զուգավորման, գեների միաձուլման, պոլիադենիլացման և mRNA իզոֆորմների քանակականացմանը:
Nanopore sequencing, մեթոդ, որը հիմնված է նանոպորով մեկ մոլեկուլ իրական ժամանակի էլեկտրական ազդանշանների վրա, արդյունքներ է տալիս իրական ժամանակում: Ղեկավարվելով շարժիչային սպիտակուցներով՝ երկշղթա ԴՆԹ-ն կապվում է կենսաթաղանթի մեջ ներկառուցված նանոպորային սպիտակուցների հետ՝ լարման տարբերության տակ անցնելիս նանոպորային միջանցքով անցնելիս: ԴՆԹ-ի շղթայի տարբեր հիմքերի կողմից գեներացված տարբերակիչ էլեկտրական ազդանշանները հայտնաբերվում և դասակարգվում են իրական ժամանակում՝ հեշտացնելով նուկլեոտիդների ճշգրիտ և շարունակական հաջորդականությունը: Այս նորարարական մոտեցումը հաղթահարում է կարճ ընթերցման սահմանափակումները և ապահովում է դինամիկ հարթակ բարդ գենոմային վերլուծության համար, ներառյալ բարդ տրանսկրիպտոմիական հետազոտությունները՝ անմիջական արդյունքներով:
Պլատֆորմ՝ Nanopore PromethION 48
-
Ամբողջ երկարությամբ mRNA հաջորդականություն - PacBio
Թեև NGS-ի վրա հիմնված mRNA-ի հաջորդականությունը բազմակողմանի գործիք է գեների արտահայտման քանակականացման համար, դրա կախվածությունը կարճ ընթերցումների վրա սահմանափակում է դրա օգտագործումը բարդ տրանսկրիպտոմիկ վերլուծություններում: Մյուս կողմից, PacBio հաջորդականությունը (Iso-Seq) օգտագործում է երկար կարդացվող տեխնոլոգիա՝ հնարավորություն տալով ամբողջական երկարությամբ mRNA տառադարձումների հաջորդականությունը: Այս մոտեցումը հեշտացնում է այլընտրանքային զուգավորման, գեների միաձուլման և պոլիադենիլացման համապարփակ ուսումնասիրությունը: Այնուամենայնիվ, կան գեների արտահայտման քանակականացման այլ տարբերակներ՝ պահանջվող տվյալների մեծ քանակի պատճառով: PacBio հաջորդականության տեխնոլոգիան հենվում է մեկ մոլեկուլային, իրական ժամանակի (SMRT) հաջորդականության վրա, ինչը հստակ առավելություն է տալիս ամբողջական երկարությամբ mRNA տառադարձումները գրավելու համար: Այս նորարարական մոտեցումը ներառում է զրոյական ռեժիմի ալիքատարների (ZMWs) և միկրոֆաբրիկացված հորերի օգտագործումը, որոնք հնարավորություն են տալիս իրական ժամանակում դիտարկել ԴՆԹ պոլիմերազի ակտիվությունը հաջորդականության ընթացքում: Այս ZMW-ներում PacBio-ի ԴՆԹ պոլիմերազը սինթեզում է ԴՆԹ-ի լրացուցիչ շղթա՝ առաջացնելով երկար ընթերցումներ, որոնք ընդգրկում են mRNA տառադարձումների ամբողջությունը: PacBio-ի աշխատանքը Circular Consensus sequencing (CCS) ռեժիմում բարձրացնում է ճշգրտությունը՝ միևնույն մոլեկուլը բազմիցս հաջորդականացնելով: Ստեղծված HiFi ընթերցումները ունեն NGS-ի հետ համեմատելի ճշգրտություն, ինչը հետագայում նպաստում է բարդ տրանսկրիպտոմիական հատկանիշների համապարփակ և հուսալի վերլուծությանը:
Պլատֆորմ՝ PacBio Sequel II; PacBio Revio
-
Էուկարիոտիկ mRNA Sequencing-NGS
mRNA հաջորդականությունը՝ բազմակողմանի տեխնոլոգիա, հնարավորություն է տալիս բջիջների ներսում բոլոր mRNA տառադարձումների համապարփակ պրոֆիլավորմանը հատուկ պայմաններում: Իր լայնածավալ կիրառություններով՝ այս առաջադեմ գործիքը բացահայտում է գենային արտահայտման բարդ պրոֆիլներ, գենային կառուցվածքներ և մոլեկուլային մեխանիզմներ՝ կապված տարբեր կենսաբանական գործընթացների հետ: Լայնորեն ընդունված հիմնարար հետազոտությունների, կլինիկական ախտորոշման և թմրամիջոցների մշակման մեջ՝ mRNA հաջորդականությունը պատկերացումներ է տալիս բջջային դինամիկայի և գենետիկական կարգավորման բարդությունների մասին՝ հետաքրքրություն առաջացնելով դրա ներուժի վերաբերյալ տարբեր ոլորտներում:
Պլատֆորմ՝ Illumina NovaSeq X; DNBSEQ-T7
-
Ոչ հղման վրա հիմնված mRNA Sequencing-NGS
mRNA հաջորդականությունը թույլ է տալիս բջիջների ներսում բոլոր mRNA տառադարձումների համապարփակ պրոֆիլավորումը հատուկ պայմաններում: Այս գերժամանակակից տեխնոլոգիան ծառայում է որպես հզոր գործիք՝ բացահայտելով գեների արտահայտման բարդ պրոֆիլներ, գենային կառուցվածքներ և մոլեկուլային մեխանիզմներ՝ կապված տարբեր կենսաբանական գործընթացների հետ: Լայնորեն ընդունված հիմնարար հետազոտությունների, կլինիկական ախտորոշման և դեղերի մշակման մեջ՝ mRNA հաջորդականությունը տալիս է պատկերացումներ բջջային դինամիկայի և գենետիկական կարգավորման բարդությունների վերաբերյալ:
Պլատֆորմ՝ Illumina NovaSeq X; DNBSEQ-T7
-
Long Non-coding Sequencing-Illumina
Երկար չկոդավորող ՌՆԹ-ները (lncRNAs) ավելի երկար են, քան 200 նուկլեոտիդներ, որոնք ունեն նվազագույն կոդավորման ներուժ և առանցքային տարրեր են ոչ կոդավորող ՌՆԹ-ում: Միջուկում և ցիտոպլազմայում հայտնաբերված այս ՌՆԹ-ները վճռորոշ դեր են խաղում էպիգենետիկ, տրանսկրիպցիոն և հետտրանսկրիպցիոն կարգավորման մեջ՝ ընդգծելով դրանց նշանակությունը բջջային և մոլեկուլային գործընթացների ձևավորման գործում: LncRNA հաջորդականությունը հզոր գործիք է բջիջների տարբերակման, օնտոգենեզի և մարդու հիվանդությունների համար:
Հարթակ՝ Illumina NovaSeq
-
Փոքր ՌՆԹ-ի հաջորդականացում-Իլյումինա
Փոքր ՌՆԹ (sRNA) մոլեկուլները ներառում են միկրոՌՆԹ-ներ (miRNAs), փոքր միջամտող ՌՆԹ-ներ (siRNAs) և piwi-փոխազդող ՌՆԹ-ներ (piRNAs): Դրանցից 18-25 նուկլեոտիդների երկարությամբ miRNA-ները հատկապես ուշագրավ են տարբեր բջջային գործընթացներում իրենց առանցքային կարգավորիչ դերերով: Հյուսվածքային և փուլային արտահայտման ձևերով, miRNA-ները բարձր պահպանվածություն են ցուցաբերում տարբեր տեսակների մեջ:
Հարթակ՝ Illumina NovaSeq
-
CircRNA Sequencing-Illumina
Շրջանաձև ՌՆԹ-ի հաջորդականությունը (circRNA-seq) շրջանաձև ՌՆԹ-ների պրոֆիլավորումն ու վերլուծությունն է, ՌՆԹ-ի մոլեկուլների դաս, որոնք փակ օղակներ են կազմում ոչ կանոնական զուգավորման իրադարձությունների պատճառով՝ ապահովելով այս ՌՆԹ-ի կայունությունը: Թեև որոշ circRNA-ներ գործում են որպես միկրոՌՆԹ-ի սպունգներ՝ անջատելով միկրոՌՆԹ-ները և թույլ չեն տալիս նրանց կարգավորել իրենց թիրախային mRNA-ները, մյուս circRNA-ները կարող են փոխազդել սպիտակուցների հետ, փոփոխել գեների արտահայտությունը կամ դեր ունենալ բջջային գործընթացներում: circRNA-ի արտահայտման վերլուծությունը հնարավորություն է տալիս պատկերացում կազմել այս մոլեկուլների կարգավորիչ դերերի և դրանց նշանակության մասին տարբեր բջջային գործընթացներում, զարգացման փուլերում և հիվանդության պայմաններում՝ նպաստելով գեների արտահայտման համատեքստում ՌՆԹ կարգավորման բարդության ավելի խորը ըմբռնմանը:
-
Ամբողջ տրանսկրիպտոմի հաջորդականություն – Illumina
Ամբողջ տրանսկրիպտոմային հաջորդականությունը առաջարկում է համապարփակ մոտեցում ՌՆԹ-ի տարբեր մոլեկուլների պրոֆիլավորման համար՝ ընդգրկելով կոդավորող (mRNA) և ոչ կոդավորող ՌՆԹ-ներ (lncRNA, circRNA և miRNA): Այս տեխնիկան ֆիքսում է կոնկրետ բջիջների ամբողջ տրանսկրիպտոմը տվյալ պահին՝ թույլ տալով ամբողջական պատկերացում կազմել բջջային գործընթացների մասին: Նաև հայտնի է որպես «ընդհանուր ՌՆԹ-ի հաջորդականություն», այն նպատակ ունի բացահայտել բարդ կարգավորիչ ցանցերը տրանսկրիպտոմի մակարդակում՝ թույլ տալով խորը վերլուծություն, ինչպիսիք են մրցակցող էնդոգեն ՌՆԹ-ն (ceRNA) և համատեղ ՌՆԹ վերլուծությունը: Սա նախանշում է ֆունկցիոնալ բնութագրման սկզբնական քայլը, մասնավորապես, կարգավորիչ ցանցերի բացահայտման գործում, որոնք ներառում են circRNA-miRNA-mRNA վրա հիմնված ceRNA փոխազդեցությունները:
