Egymagvú RNS szekvenálás
Műszaki séma
A magok izolálását a 10× Genomics Chromium™ biztosítja, amely nyolccsatornás mikrofluidikai rendszerből áll, kettős keresztezésekkel. Ebben a rendszerben egy vonalkóddal és primerrel, enzimekkel és egyetlen maggal ellátott gélgyöngyöket nanoliteres olajcseppbe kapszuláznak, így Gel Bead-in-Emulsion (GEM) keletkezik. A GEM kialakulása után minden GEM-ben megtörténik a sejtlízis és a vonalkódok felszabadítása. Az mRNS-t 10-szeres vonalkóddal és UMI-val ellátott cDNS-molekulákká reverzi átírják, amelyekre a továbbiakban szabványos szekvenálókönyvtár-építés vonatkozik.
Jellemzők
● Egymagos szuszpenzió készítése fagyasztott szövetekből
● Gel Bead-in-Emulsion (GEM) kialakítása, majd cDNS szintézis
● A GEM minden gyöngye 4 részből álló primerekkel van feltöltve:
poli(dT) farok mRNS indításhoz és cDNS szintézishez,
Egyedi molekuláris azonosító (UMI) az amplifikációs torzítás korrigálására
10x vonalkód
A részleges leolvasás 1 szekvenáló primer kötőszekvenciája
Előnyök
Az egymagos RNS szekvenálás megkerüli az egysejtű RNS szekvenálás korlátait, lehetővé téve:
● Fagyasztott minták használata, nem csak a friss mintákra korlátozva
● A fagyasztott sejtek alacsony stressze a friss sejtek enzimatikus kezeléséhez képest, ami a transzkriptom adatokban kevésbé stressz-indukált gének formájában tükröződik
● Nincs szükség a vörösvértestek előzetes eltávolítására
● Korlátlan cellaátmérő
● Az elemzésre alkalmas minták széles skálája, beleértve az összetett és törékeny szövettípusokat, amelyek hajlamosak a sejtek összetapadására vagy pusztulására a szöveti disszociáció során
Azok a minták, amelyek egysejtű RNS-szekvenálással nem elemezhetők, és alkalmasak egymagos RNS-szekvenálásra:
| Sejt/szövet | Ok |
| Friss, fagyasztott szövet | Nem lehet friss vagy régóta mentett szervezeteket szerezni |
| Izomsejt, Megakariocita, Zsír… | A cella átmérője túl nagy ahhoz, hogy belépjen a műszerbe |
| Máj… | Túl törékeny a töréshez, nem képes megkülönböztetni az egyes sejteket |
| Neuronsejt, agy… | Érzékenyebb, könnyen stresszelhető, megváltoztatja a szekvenálási eredményeket |
| Hasnyálmirigy, pajzsmirigy… | Endogén enzimekben gazdag, befolyásolja az egysejt-szuszpenzió termelését |
Egymagos vs egysejtű
| Egymagvú | Egysejtű |
| Korlátlan cellaátmérő | Sejtátmérő: 10-40 μm |
| Az anyag lehet fagyasztott szövet | Az anyagnak friss szövetnek kell lennie |
| A fagyott sejtek alacsony stressze | Az enzimkezelés sejtstressz reakciót válthat ki |
| Nem kell eltávolítani a vörösvértesteket | A vörösvértesteket el kell távolítani |
| A nukleáris bioinformációt fejez ki | Az egész sejt bioinformációt fejez ki |
Műszaki adatok
| Mintakövetelmények | Könyvtár | Szekvenálási stratégia | Ajánlott adatok | Minőségellenőrzés |
| Állati szövet ≥ 200 mg Növényi szövet ≥ 400 mg | 10x Genomics sn cDNS könyvtár | Illumina PE150 | 100K PE olvasás cellánként (100-200 Gb) | 700-1200 mag/μl és a magok integritása mikroszkóp alatt megfigyelhető |
A mintakészítési útmutatóval és a szervizmunkafolyamattal kapcsolatos további részletekért forduljon bizalommal aBMKGENE szakértő
Szerviz munkafolyamat
A következő elemzést tartalmazza:
● Minőségellenőrzés: sejtek száma, géndetektálás, sejtek pontos azonosítása, RNS molekulák és expresszió mennyiségi meghatározása
● Belső mintaelemzés:
Cellacsoportosítás és fürt annotáció
Differential Expression Analysis: DEG-ek azonosítása klaszterekben
A klaszter DEG-ek funkcionális annotációja és gazdagítása
● Csoportközi elemzés:
Adatok kombinációja
Differenciális expressziós elemzés: a DEG-ek azonosítása csoportokban
Csoport DEG-ek funkcionális annotációja és gazdagítása
● Speciális elemzés:
Sejtciklus elemzés
Pszeudoidő elemzés
Mobilkommunikációs elemzés (CellPhoneDB)
Génkészlet-dúsítási elemzés (GSEA)
Belső minta elemzés
Sejtklaszterezés:
Differenciálkifejezés-elemzés: klaszter DEG
Csoportközi elemzés
Differenciálkifejezés-elemzés: Csoport DEG
Speciális elemzés:
Pszeudoidő elemzés:
Sejtciklus elemzés:
Fedezze fel a BMKGene egymagos RNS-szekvenálási szolgáltatásai által a 10X Chromium által elérhető fejlesztéseket ezekben a kiemelt kiadványokban:
Wang, L. et al. (2021) „Az egysejtes transzkriptomikai elemzés feltárja a tüdő immunrendszerét a szteroid-rezisztens asztma súlyosbodásában”Proceedings of the National Academy of Sciences of Amerikai Egyesült Államok, 118. (2), p. e2005590118. doi: 10.1073/pnas.2005590118
Zheng, H. et al. (2022) „Globális szabályozó hálózat az immunsejtek diszregulált génexpressziójához és abnormális metabolikus jelátvitelhez a Graves-kór és a Hashimoto-thyreoiditis mikrokörnyezetében”,Az immunológia határai, 13. o. 879824. doi: 10.3389/FIMMU.2022.879824/BIBTEX.
Tian, H. et al. (2023) „Az egysejtű transzkriptom feltárja a leukociták heterogenitását és immunválaszait lepényhalban (Paralichthys olivaceus) végzett inaktivált Edwardsiella tarda-val végzett vakcinázás után”,Akvakultúra, 566, p. 739238. doi: 10.1016/J.AQUACULTURE.2023.739238.
Yu, Y. et al. (2023) "A fotodinamikus terápia javítja az immunellenőrzési pont inhibitorok kimenetelét azáltal, hogy átalakítja a daganatellenes immunitást gyomorrákos betegeknél"Gyomorrák, 26(5), 798–813. doi: 10.1007/S10120-023-01409-X/METRICS.
