TELJES GENÓM UTASÍTÁSA
A SARS-CoV-2 genomikai megfigyelése egy Nsp1 deléciós változatot tár fel, amely modulálja az I. típusú interferonválaszt
Nanopore | Illumina | A teljes genom újraszekvenálása | metagenomika | RNS-Seq | Sanger
A Biomarker Technologies technikai támogatást nyújtott a mintaszekvenáláshoz ebben a tanulmányban.
Kiemelések
1. A SARS-CoV-2 genom szekvenálása és filogenetikai elemzése 35 visszatérő mutációt azonosít, köztük 31 SNP-t és 4 Indelt.
2. A 117 klinikai fenotípussal való kapcsolat potenciálisan feltárja
fontos mutációk.
A ∆500-532 az Nsp1 kódoló régióban korrelál az alacsonyabb vírussal
3.terhelés és szérum IFN-β.
4. A ∆500-532 mutációt tartalmazó vírusizolátumok alacsonyabb IFN-I-t indukálnak
válasz a fertőzött sejtekben.
Kísérleti tervezés
Eredmények
1. COVID-19 járványügyi és genomikai felügyelet
A klinikai adatokat a kínai Szecsuán tartományban gyűjtötték a 2020. január 22. és 2020. február 20. közötti járványkitörési időszakban. Összesen 538 COVID-19 esetet erősítettek meg Szecsuánban a qPCR-tesztek, amelyek 28,8%-a a tartományból származott. tőke. Szecsuánban exponenciálisan nőtt a megerősített esetek száma, és január 30-án érte el a csúcsot. Az adatok azt is alátámasztották, hogy a társadalmi távolságtartás kulcsfontosságú tényező lehet a vírus terjedésének megakadályozásában.
1. ábra: A COVID-19 epidemiológiai vizsgálata Szecsuán tartományban, Kínában
2. SARS-CoV-2 genom konstrukció és variánsok azonosítása
Multiplex PCR amplifikációval, majd nanopórus szekvenálással összesen 310 majdnem vagy részlegesen teljes genomot hoztak létre 248 betegből kb. A genomok 80%-át 10 leolvasás fedi le (átlagos mélység: 0,39 M leolvasás mintánként).
2. ábra: Az egyes változatok gyakorisága a szecsuáni kohorszban
A SARS-CoV-2 genomokból összesen 104 SNP-t és 18 Indelt azonosítottak, amelyekben 31 SNP-t és 4 Indelt azonosítottak visszatérő genetikai variánsként. Összehasonlítva őket 169 vuhani mintával és 81 391 kiváló minőségű nyilvános genomszekvenciával a GISAID-ben, a talált 35 variáns közül 29 más kontinensen is bemutatkozott. Négy változat, köztük a ∆500-532, az ACC18108AT, a ∆729-737 és a T13243C, csak Szecsuánban és Vuhanban volt jelen, és hiányzik a GISAID-adatokból, ami azt jelzi, hogy ezek a változatok nagy valószínűséggel Wuhanból kerültek ki, amelyek megfelelnek a követelményeknek. a betegek utazási nyilvántartásai.
A maximum likelihood (ML) módszerrel és bayesi molekuláris óra megközelítéssel végzett evolúciós elemzést 88 új szecsuáni víruson és 250 más régiókból származó kurált genomon dolgozták fel. A ∆500-532-es genomokat (deléciók az Nsp1 kódoló régióban) ritkán találtuk a filogenetikai fában. Az Nsp1 variánsokon végzett haplotípus-analízis ötöt azonosított több városból. Ezek az eredmények azt sugallták, hogy a ∆500-532 több városban is előfordult, és többször is importálhatták Vuhanból.
2. ábra: Ismétlődő genetikai variánsok és filogenetikai elemzés a SARS-CoV-2 genomokban
3. Rekurrens genetikai variánsok klinikai vonatkozású asszociációja
117 klinikai fenotípust társítottak a COVID-19 súlyosságához, ahol 19, a súlyossággal összefüggő fenotípust súlyos és nem súlyos tulajdonságokba soroltak. E tulajdonságok és 35 visszatérő genetikai variáns közötti kapcsolatot biklaszteres hőtérképen vizsgáltuk. Egy GSEA-szerű rangsorolt dúsítási analízis kimutatta, hogy a ∆500-532 negatívan korrelál az ESR-rel, a szérum IFN-β és CD3+CD8+ T-sejtszámmal a vérben. Ezenkívül a qPCR tesztek kimutatták, hogy a ∆500-532 vírussal fertőzött betegeknél volt a legmagasabb Ct, azaz a legalacsonyabb a vírusterhelés.
3. ábra: 35 visszatérő genetikai variáns összefüggései klinikai fenotípusokkal
4. A vírusmutációval összefüggő klinikai fenotípusok validálása
Annak érdekében, hogy megértsük a ∆500-532 hatását az Nsp1 funkciókra, HEK239T sejteket transzfektáltunk teljes hosszúságú, WT Nsp1 és deléciós mutáns formákat expresszáló plazmidokkal. Az egyes kezelt HEK239T sejtek transzkriptomprofiljait PCA analízishez feldolgoztuk, ami azt mutatja, hogy a deléciós mutánsok viszonylag közelebb csoportosultak, és szignifikánsan különböznek a WT Nsp1-től. A mutánsokban szignifikánsan felszabályozott gének főként a „peptid bioszintetikus/metabolikus folyamatban”, „ribonukleoprotein komplex biogenezisben”, „membránba/ER-be történő fehérje célzásban” stb. gazdagodtak. Ezen túlmenően két deléció a WT-től eltérő expsziós mintát mutatott.
4. ábra: WT Nsp1-gyel transzfektált és deléciós HEK239T-sejtek transzkriptomaanalízise
A delécióknak az IFN-1 válaszra gyakorolt hatását túlexpresszált vizsgálatban is tesztelték. Kimutatták, hogy az összes tesztelt deléció csökkenti az IFN-1 reakciót a transzfektált HEK239T és A549 sejtekben mind a transzkriptom, mind a fehérje szinten. Érdekes módon a jelentős mértékben leszabályozott gének a deléciókban gazdagodtak a „vírus elleni védekezési válaszban”, a „vírus genom replikációjában”, „az RNS-polimeráz II-es transzkripció szabályozásában” és az „I-es típusú interferonra adott válaszban”.
5. ábra: Az interferon jelátviteli útvonalak leszabályozása ∆500-532 mutánsban
Ebben a vizsgálatban ezeknek a delécióknak a vírusra gyakorolt hatását vírusfertőzési vizsgálatok is megerősítették. Bizonyos mutánsokat tartalmazó vírusokat klinikai mintákból izoláltunk, és Calu-3 sejteket fertőztünk meg. A vírusfertőzés vizsgálatának részletes eredményei a lapban olvashatók.
doi:10.1016/j.chom.2021.01.015
Referencia
Lin J, Tang C, Wei H és mtsai. A SARS-CoV-2 genomiális monitorozása egy Nsp1 deléciós változatot tár fel, amely modulálja az I. típusú interferonválaszt [J]. Sejtgazda és mikroba, 2021.
Hírek és kiemelések célja a legújabb sikeres esetek megosztása a Biomarker Technologies vállalattal, megörökítve az új tudományos eredményeket, valamint a tanulmány során alkalmazott kiemelkedő technikákat.
Feladás időpontja: 2022-06-06