Jednojezgreno sekvenciranje RNA
Tehnička shema
Izolacija jezgri postiže se 10× Genomics Chromium™, koji se sastoji od osmokanalnog mikrofluidnog sustava s dvostrukim križanjima. U ovom sustavu, kuglice gela s bar kodovima i primerom, enzimi i jedna jezgra su inkapsulirane u kapi ulja veličine nanolitra, generirajući Gel kuglice u emulziji (GEM). Nakon što se GEM formira, liza stanica i oslobađanje crtičnih kodova izvodi se u svakom GEM-u. mRNA se reverzno transkribira u cDNA molekule s 10× bar kodovima i UMI, koje su dalje podložne standardnoj konstrukciji knjižnice sekvenciranja.
Značajke
● Priprema suspenzije jedne jezgre iz smrznutog tkiva
● Stvaranje gel kuglica u emulziji (GEM) nakon čega slijedi sinteza cDNA
● Svaka kuglica u GEM-u napunjena je primerima koji se sastoje od 4 dijela:
poli(dT) rep za mRNA priming i cDNA sintezu,
Jedinstveni molekularni identifikator (UMI) za ispravljanje pristranosti pojačanja
10x barkod
Vezuća sekvenca parcijalnog čitanja 1 početnice za sekvenciranje
Prednosti
Jednojezgreno RNA sekvenciranje zaobilazi ograničenja jednostaničnog RNA sekvenciranja, omogućujući:
● Korištenje smrznutih uzoraka, a ne samo ograničeno na svježe uzorke
● Nizak stres zamrznutih stanica u usporedbi s enzimskim tretmanom svježih stanica, što se odražava u podacima transkriptoma u obliku gena manje izazvanih stresom
● Nema potrebe za prethodnim uklanjanjem crvenih krvnih stanica
● Neograničen promjer ćelije
● Veliki niz uzoraka koji su podobni za analizu, uključujući složene i krhke vrste tkiva koje su sklone nakupljanju ili uništavanju stanica tijekom disocijacije tkiva
Uzorci koji se ne mogu analizirati jednostaničnim RNA sekvenciranjem, a podobni su za jednojezgreno RNA sekvenciranje:
| Stanica/tkivo | Razlog |
| Nesvježe smrznuto tkivo | Nije moguće dobiti nove ili dugo spremljene organizacije |
| Mišićna stanica, megakariocit, mast… | Promjer ćelije je prevelik za ulazak u instrument |
| Jetra… | Previše krhko da bi se slomilo, ne može razlikovati pojedinačne stanice |
| Neuronska stanica, mozak… | Osjetljiviji, lakši za stres, promijenit će rezultate sekvenciranja |
| Gušterača, štitnjača… | Bogat endogenim enzimima koji utječu na proizvodnju suspenzije pojedinačnih stanica |
Jednojezgreni vs jednostanični
| Jednojezgreni | Jednoćelijski |
| Neograničen promjer ćelije | Promjer ćelije: 10-40 μm |
| Materijal može biti smrznuto tkivo | Materijal mora biti svježe tkivo |
| Nizak stres zamrznutih stanica | Tretman enzimima može izazvati stresnu reakciju stanica |
| Ne treba uklanjati crvena krvna zrnca | Potrebno je ukloniti crvena krvna zrnca |
| Nuklearna izražava bioinformaciju | Cijela stanica izražava bioinformacije |
Tehnički podaci
| Zahtjevi za uzorke | Knjižnica | Strategija sekvenciranja | Preporučeni podaci | Kontrola kvalitete |
| Životinjsko tkivo ≥ 200 mg Biljno tkivo ≥ 400 mg | 10x Genomics sn cDNA biblioteka | Ilumina PE150 | 100K PE čitanja po ćeliji (100-200 Gb) | 700-1200 jezgri/μl i cjelovitost jezgri promatrana pod mikroskopom |
Za više pojedinosti o smjernicama za pripremu uzoraka i tijeku rada usluge, slobodno razgovarajte s aBMKGENE stručnjak
Tijek rada usluge
Uključuje sljedeću analizu:
● Kontrola kvalitete: broj stanica, detekcija gena, točna identifikacija stanica, RNA molekula i kvantifikacija ekspresije
● Unutarnja analiza uzorka:
Grupiranje stanica i označavanje klastera
Analiza diferencijalne ekspresije: identifikacija DEG u klasterima
Funkcionalna anotacija i obogaćivanje DEG-ova klastera
● Međugrupna analiza:
Kombinacija podataka
Analiza diferencijalne ekspresije: identifikacija DEG u skupinama
Funkcionalna anotacija i obogaćivanje grupnih DEG-ova
● Napredna analiza:
Analiza staničnog ciklusa
Analiza pseudovremena
Analiza mobilne komunikacije (CellPhoneDB)
Analiza obogaćivanja skupa gena (GSEA)
Analiza unutarnjeg uzorka
Grupiranje stanica:
Diferencijalna ekspresijska analiza: klaster DEG
Međugrupna analiza
Diferencijalna ekspresijska analiza: grupni DEG
Napredna analiza:
Analiza pseudovremena:
Analiza staničnog ciklusa:
Istražite napredak omogućen BMKGeneovim uslugama sekvenciranja jednojezgrene RNA od strane 10X Chromiuma u ovim istaknutim publikacijama:
Wang, L. i sur. (2021) 'Jednostanična transkriptomska analiza otkriva imunološki krajolik pluća u egzacerbaciji astme otporne na steroide',Zbornik radova Nacionalne akademije znanosti Sjedinjenih Američkih Država, 118(2), str. e2005590118. doi: 10.1073/pnas.2005590118
Zheng, H. i sur. (2022) 'Globalna regulatorna mreža za disreguliranu ekspresiju gena i abnormalno metaboličko signaliziranje u imunološkim stanicama u mikrookruženju Gravesove bolesti i Hashimotovog tiroiditisa',Granice u imunologiji, 13, str. 879824. doi: 10.3389/FIMMU.2022.879824/BIBTEX.
Tian, H. i sur. (2023) 'Jednostanični transkriptom otkriva heterogenost i imunološki odgovor leukocita nakon cijepljenja s inaktiviranom Edwardsiella tarda u iverka (Paralichthys olivaceus)',Akvakultura, 566, str. 739238. doi: 10.1016/J.AQUACULTURE.2023.739238.
Yu, Y. i sur. (2023.) 'Fotodinamička terapija poboljšava ishod inhibitora imunoloških kontrolnih točaka remodeliranjem antitumorskog imuniteta u bolesnika s rakom želuca',Rak želuca, 26(5), str. 798–813. doi: 10.1007/S10120-023-01409-X/METRIKA.
