Exclusive Agency for Korea

Produtos

Secuenciación de ARN de núcleo único

O desenvolvemento de técnicas de captura unicélula e de construción de bibliotecas personalizadas, xunto coa secuenciación de alto rendemento, revolucionou os estudos de expresión xénica a nivel celular. Este avance permite unha análise máis profunda e completa das poboacións celulares complexas, superando as limitacións asociadas coa expresión media dos xenes en todas as células e preservando a verdadeira heteroxeneidade dentro destas poboacións. Aínda que a secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) ten vantaxes innegables, atópase con retos en certos tecidos nos que a creación dunha suspensión unicelular resulta difícil e require mostras novas. En BMKGene, abordamos este obstáculo ofrecendo a secuenciación de ARN dun só núcleo (snRNA-seq) utilizando a tecnoloxía 10X Genomics Chromium de última xeración. Este enfoque amplía o espectro de mostras susceptibles de análise de transcriptoma a nivel de célula única.

O illamento dos núcleos realízase a través do innovador chip 10X Genomics Chromium, que presenta un sistema de microfluídica de oito canles con dobres cruzamentos. Dentro deste sistema, as perlas de xel que incorporan códigos de barras, cebadores, encimas e un só núcleo están encapsuladas en gotas de aceite do tamaño dun nanolitro, formando Gel Bead-in-Emulsion (GEM). Despois da formación do GEM, a lise celular e a liberación do código de barras ocorren dentro de cada GEM. Posteriormente, as moléculas de ARNm pasan a transcrición inversa en cDNA, incorporando códigos de barras 10X e identificadores moleculares únicos (UMI). Estes ADNc son entón sometidos á construción de bibliotecas de secuenciación estándar, o que facilita unha exploración robusta e completa dos perfís de expresión xénica a nivel unicelular.

Plataforma: plataforma 10× Genomics Chromium e Illumina NovaSeq

Contacta connosco

Detalles do servizo

Bioinformática

Resultados da demostración

Publicacións destacadas

Esquema Técnico

O illamento dos núcleos conséguese mediante 10× Genomics Chromium™, que consiste en un sistema microfluídico de oito canles con dobres cruzamentos. Neste sistema, unhas esferas de xel con códigos de barras e imprimación, encimas e un só núcleo están encapsulados nunha gota de aceite do tamaño dun nanolitro, xerando Gel Bead-in-Emulsion (GEM). Unha vez que se forman os GEM, realízase a lise celular e a liberación de códigos de barras en cada GEM. O ARNm transcríbense inversamente en moléculas de ADNc con códigos de barras 10× e UMI, que están ademais suxeitos á construción de bibliotecas de secuenciación estándar.

Características

● Preparación de suspensión de núcleo único a partir de tecidos conxelados

● Formación de perlas de xel en emulsión (GEM) seguida da síntese de cDNA

● Cada perla dun GEM está cargada con imprimacións compostas por 4 seccións:

cola poli(dT) para cebado de ARNm e síntese de ADNc,

Identificador molecular único (UMI) para corrixir o sesgo de amplificación

10x código de barras

Secuencia de unión do cebador de secuenciación de lectura parcial 1

Vantaxes

A secuenciación de ARN dun só núcleo elude as limitacións da secuenciación de ARN unicelular, permitindo:

● O uso de mostras conxeladas e non só limitadas a mostras frescas

● Baixo estrés das células conxeladas en comparación co tratamento enzimático de células frescas, reflectido nos datos do transcriptoma en forma de xenes menos inducidos polo estrés.

● Non é necesaria a eliminación previa de glóbulos vermellos

● Diámetro celular ilimitado

● Gran variedade de mostras aptas para a análise, incluídos os tipos de tecidos complexos e fráxiles que son propensos a aglutinación ou destrución celular durante a disociación do tecido.

Mostras que non se poden analizar mediante a secuenciación de ARN unicelular e son aptas para a secuenciación de ARN de núcleo único:

Célula/Tecido	Razón
Tecido conxelado non fresco	Non se poden obter organizacións novas ou gardadas desde hai moito tempo
Célula muscular, megacariocito, graxa...	O diámetro da cela é demasiado grande para entrar no instrumento
Fígado…	Demasiado fráxil para romper, incapaz de distinguir células individuais
Célula neuronal, cerebro...	Máis sensible, fácil de estresar, cambiará os resultados da secuenciación
Páncreas, Tiroides...	Rico en enzimas endóxenas, que afectan á produción de suspensión celular única

Núcleo único vs

Un único núcleo	Monocélula
Diámetro celular ilimitado	Diámetro celular: 10-40 μm
O material pode ser tecido conxelado	O material debe ser tecido fresco
Baixo estrés das células conxeladas	O tratamento con enzimas pode provocar reaccións de estrés celular
Non é necesario eliminar glóbulos vermellos	Os glóbulos vermellos deben ser eliminados
Nuclear expresa bioinformación	Toda a célula expresa bioinformación

Especificacións

Requisitos de mostra

Biblioteca

Estratexia de secuenciación

Datos recomendados

Control de calidade

Tecido animal ≥ 200 mg

Tecido vexetal ≥ 400 mg

10x biblioteca de ADNc de Genomics sn

Illumina PE150

100K lecturas PE por cela

(100-200 Gb)

700-1200 núcleos/μl e integridade dos núcleos observada ao microscopio

Para obter máis detalles sobre a orientación de preparación de mostras e o fluxo de traballo do servizo, non dubide en falar con aExperto en BMKGENE

Fluxo de traballo do servizo

Anterior: Secuenciación do xenoma completo de plantas/animais

Seguinte: Análise de asociación de todo o xenoma

Inclúe a seguinte análise:

● Control de calidade: número de células, detección de xenes, identificación precisa de células, moléculas de ARN e cuantificación da expresión.

● Análise de mostra interna:

Agrupación celular e anotación de cluster

Análise da expresión diferencial: identificación de DEG en clusters

Anotación funcional e enriquecemento dos DEG de clúster

● Análise intergrupal:

Combinación de datos

Análise da expresión diferencial: identificación de DEG en grupos

Anotación funcional e enriquecemento dos DEG de grupo

● Análise avanzada:

Análise do ciclo celular

Análise pseudotemporal

Análise da comunicación celular (CellPhoneDB)

Análise de enriquecemento de conxuntos xenéticos (GSEA)

Análise da mostra interna

Agrupación celular:

Análise da expresión diferencial: DEG de clúster

Análise intergrupal

Análise da expresión diferencial: Grupo DEG

Análise avanzada:

Análise pseudotemporal:

Análise do ciclo celular:

Explore os avances facilitados polos servizos de secuenciación de ARN dun só núcleo de BMKGene por 10X Chromium nestas publicacións destacadas:

Wang, L. et al. (2021) "A análise transcriptómica unicelular revela a paisaxe inmune do pulmón na exacerbación da asma resistente aos esteroides",Actas da Academia Nacional de Ciencias dos Estados Unidos de América, 118(2), páx. e2005590118. doi: 10.1073/pnas.2005590118

Zheng, H. et al. (2022) "A Global Regulatory Network for Disregulated Gene Expression and Annormal Metabolic Signaling in Immune Cells in the Microenvironment of Graves' Disease and Hashimoto's Tiroiditis",Fronteiras en Inmunoloxía, 13, páx. 879824. doi: 10.3389/FIMMU.2022.879824/BIBTEX.

Tian, H. et al. (2023) "O transcriptoma unicelular descobre a heteroxeneidade e as respostas inmunitarias dos leucocitos despois da vacinación con Edwardsiella tarda inactivada na platija (Paralichthys olivaceus)".Acuicultura, 566, páx. 739238. doi: 10.1016/J.ACUICULTURA.2023.739238.

Yu, Y. et al. (2023) "A terapia fotodinámica mellora o resultado dos inhibidores do punto de control inmunitario mediante a remodelación da inmunidade antitumoral en pacientes con cancro gástrico".Cancro gástrico, 26 (5), páxinas 798–813. doi: 10.1007/S10120-023-01409-X/METRICS.