Single-nuclei RNA Sequencing
Technyske skema
De isolaasje fan kearnen wurdt berikt troch 10 × Genomics Chromium ™, dat bestiet út acht-kanaal mikrofluidyksysteem mei dûbele krusingen. Yn dit systeem, in gel kralen mei barcodes en primer, enzymen en in inkele kearn wurde ynkapsele yn nanoliter-sized oalje drop, generearje Gel Bead-in-Emulsion (GEM). Sadree't GEM binne foarme, sel lysis en frijlitting fan barcodes wurde útfierd yn elke GEM. mRNA wurde omkeard transkribearre yn cDNA-molekulen mei 10 × barcodes en UMI, dy't fierder ûnderwurpen binne oan standert sequencing-biblioteekkonstruksje.
Features
● Tarieding fan single-nuclei-suspensje fan beferzen weefsels
● Formaasje fan Gel Bead-in-Emulsion (GEM) folge troch cDNA-synteze
● Elke kraal yn in GEM wurdt laden mei primers gearstald út 4 seksjes:
poly(dT) sturt foar mRNA-priming en cDNA-synteze,
Unique Molecular Identifier (UMI) om amplifikaasjefoaroardielen te korrigearjen
10x barcode
Binende folchoarder fan partiel lêzen 1 sequencing primer
Foardielen
Single-nucleus RNA-sequencing omgiet de beheiningen fan single-cell RNA-sequencing, wêrtroch:
● It brûken fan beferzen samples en net allinnich beheind ta farske samples
● Lege stress fan beferzen sellen yn ferliking mei enzymatyske behanneling fan farske sellen, wjerspegele yn 'e transkriptoomgegevens yn' e foarm fan minder stress-induzearre genen
● Gjin needsaak foar foarôfgeande fuortheljen fan reade bloedsellen
● Unbeheinde seldiameter
● Grut array fan samples dy't yn oanmerking komme foar analyse, ynklusyf komplekse en fragile weefseltypen dy't gefoelich binne foar selklumping of ferneatiging by weefseldissosiaasje
Samples dy't net kinne wurde analysearre troch single-cell RNA sequencing en yn oanmerking komme foar single nuclei RNA sequencing:
| Sel / Tissue | Reden |
| Unfresh beferzen weefsel | Net mooglik om frisse of lang bewarre organisaasjes te krijen |
| Spiersel, Megakaryozyten, Fet ... | Seldiameter is te grut om it ynstrumint yn te gean |
| Lever… | Te kwetsber om te brekken, net yn steat om inkele sellen te ûnderskieden |
| Neuronsel, brein ... | Mear gefoelich, maklik te stressjen, sil de resultaten fan sequencing feroarje |
| Pankreas, schildklier ... | Ryk yn endogene enzymen, dy't ynfloed hawwe op 'e produksje fan iensellige suspensie |
Single-nucleus vs Single-cell
| Single-kearn | Single-cell |
| Unbeheinde seldiameter | Sel diameter: 10-40 μm |
| It materiaal kin beferzen weefsel wêze | It materiaal moat frisse weefsel wêze |
| Lege stress fan beferzen sellen | Enzymbehanneling kin sel-stressreaksje feroarsaakje |
| Gjin reade bloedsellen hoege te ferwiderjen | Reade bloedsellen moatte fuortsmiten wurde |
| Nuclear drukt bioynformaasje út | De hiele sel drukt bioynformaasje út |
Spesifikaasjes
| Sample Requirements | Biblioteek | Sequencing strategy | Gegevens oanrikkemandearre | Kwaliteitskontrôle |
| Animal weefsel ≥ 200 mg Plantweefsel ≥ 400 mg | 10x Genomics sn cDNA-bibleteek | Illumina PE150 | 100K PE lêzen per sel (100-200 Gb) | 700-1200 kearnen / μl en nuclei yntegriteit waarnommen ûnder mikroskoop |
Foar mear details oer sample tarieding begelieding en tsjinst workflow, nim dan gerêst te praten mei inBMKGENE ekspert
Service Work Flow
Omfettet de folgjende analyze:
● Kwaliteitskontrôle: oantal sellen, gendeteksje, krekte identifikaasje fan sellen, RNA-molekulen en ekspresjekwantifikaasje
● Ynderlike Sample Analysis:
Selklusterjen en klusterannotaasje
Differinsjaal-ekspresje-analyze: identifikaasje fan DEG's yn klusters
Funksjonele annotaasje en ferriking fan kluster DEG's
● Inter-groep Analyse:
Kombinaasje fan gegevens
Differinsjaal ekspresje analyze: identifikaasje fan DEGs yn groepen
Funksjonele annotaasje en ferriking fan groep DEGs
● Avansearre analyze:
Selssyklusanalyse
Pseudotime analyze
Selskommunikaasjeanalyse (CellPhoneDB)
Gene Set Enrichment Analysis (GSEA)
Analyse fan ynterne stekproef
Selklusterjen:
Differinsjaaloperator Expression Analysis: cluster DEGs
Inter-groep analyze
Differinsjaaloperator Expression Analysis: Group DEGs
Avansearre analyze:
Pseudotiidanalyse:
Selssyklusanalyse:
Ferkenne de foarútgong fasilitearre troch BMKGene's single-nucleus RNA-sekwinsjetsjinsten troch 10X Chromium yn dizze featured publikaasjes:
Wang, L. et al. (2021) 'Single-cell transcriptomic analyze ûntbleatet it ymmúnlânskip fan long yn steroid-resistinte astma-fergrutting',Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 118(2), s. e2005590118. doi: 10.1073/pnas.2005590118
Zheng, H. et al. (2022) 'In Global Regulatory Network foar dysregulearre genekspresje en abnormale metabolike sinjalearring yn ymmúnsellen yn' e mikroomjouwing fan Graves 'sykte en Hashimoto's thyroiditis',Frontiers in Immunology, 13, p. 879824. doi: 10.3389 / FIMMU.2022.879824 / BIBTEX.
Tian, H. et al. (2023) 'Single-cell transcriptome ûntdekt heterogeniteit en ymmúnreaksjes fan leukozyten nei faksinaasje mei ynaktivearre Edwardsiella tarda yn flunder (Paralichthys olivaceus)',Aquaculture, 566, s. 739238. doi: 10.1016 / J.AQUACULTURE.2023.739238.
Yu, Y. et al. (2023) 'Fotodynamyske terapy ferbettert de útkomst fan ymmúnkontrôle-ynhibitoren fia remodellearjen fan anty-tumor-immuniteit yn pasjinten mei maagkanker',Maagkanker, 26(5), s. 798–813. doi: 10.1007/S10120-023-01409-X/METRICS.
