Séquençage d'ARN à noyaux
Schéma technique
L'isolement des noyaux est obtenu par 10 × Genomics Chromium ™, qui comprend le système microfluidique à huit canaux avec des traversées doubles. Dans ce système, des perles de gel avec des codes-barres et une amorce, des enzymes et un seul noyau sont encapsulés dans une chute d'huile de taille nanolitre, générant des billes de gel en émulsion (GEM). Une fois la gemme formée, la lyse cellulaire et la libération de codes à barres sont effectuées dans chaque gemme. L'ARNm est transcrit inverse en molécules d'ADNc avec des codes à barres 10 × et UMI, qui sont en outre soumis à la construction de la bibliothèque de séquençage standard.
Caractéristiques
● Préparation de la suspension à nuclei à partir de tissus congelés
● Formation de perle de gel en émulsion (gemm) suivie d'une synthèse d'ADNc
● Chaque perle dans une gemme est chargée d'amorces composées de 4 sections:
Poly (dt) queue pour l'amorçage de l'ARNm et la synthèse d'ADNc,
Identifiant moléculaire unique (UMI) pour corriger le biais d'amplification
Code à barres 10x
Séquence de liaison de l'amorce de séquençage de lecture partielle 1
Avantages
Le séquençage de l'ARN à nucleus fait circule les limites du séquençage d'ARN à cellule unique, permettant:
● L'utilisation d'échantillons congelés et non seulement limité aux échantillons frais
● Faible contrainte des cellules congelées par rapport au traitement enzymatique des cellules fraîches, reflétée dans les données du transcriptome sous la forme de gènes moins induits par le stress
● Pas besoin d'élimination préalable des globules rouges
● Diamètre cellulaire illimité
● Grande gamme d'échantillons éligibles à l'analyse, y compris des types de tissus complexes et fragiles sujets à l'agrément cellulaire ou à la destruction pendant la dissociation tissulaire
Des échantillons qui ne peuvent pas être analysés par séquençage d'ARN à cellule unique et qui sont éligibles au séquençage d'ARN à noyaux:
| Cellule / tissu | Raison |
| Tissu congelé contrefresh | Impossible d'obtenir des organisations fraîches ou longues |
| Cellule musculaire, mégacaryocyte, graisse… | Le diamètre de la cellule est trop grand pour entrer dans l'instrument |
| Foie… | Trop fragile pour se casser, incapable de distinguer les cellules uniques |
| Cellule des neurones, cerveau… | Plus sensible, facile à stress, changera les résultats de séquençage |
| Pancréas, thyroïde… | Riche en enzymes endogènes, affectant la production de suspension unique |
Monocleus vs unique
| Seul nulleus | Single |
| Diamètre cellulaire illimité | Diamètre de la cellule: 10-40 μm |
| Le matériau peut être des tissus congelés | Le matériau doit être des tissus frais |
| Stress faible des cellules congelées | Le traitement enzymatique peut provoquer une réaction du stress cellulaire |
| Aucune globule rouge ne doit être enlevée | Les globules rouges doivent être éliminés |
| Le nucléaire exprime la bioinformation | La cellule entière exprime la bioinformation |
Caractéristiques
| Exigences d'échantillonnage | Bibliothèque | Stratégie de séquençage | Données recommandées | Contrôle de qualité |
| Tissu animal ≥ 200 mg Tissu végétal ≥ 400 mg | Bibliothèque ADNc de Genomics 10x Genomics | Illumina PE150 | 100k PE Reads par cellule (100-200 Go) | 700-1200 noyaux / μl et intégrité des noyaux observée au microscope |
Pour plus de détails sur les guidages de préparation des échantillons et le flux de travail de service, n'hésitez pas à parler à unExpert BMKGene
Flux de travail de service
Comprend l'analyse suivante:
● Contrôle de la qualité: nombre de cellules, détection des gènes, identification précise des cellules, des molécules d'ARN et de la quantification de l'expression
● Analyse de l'échantillon intérieur:
Clustering de cellules et annotation en grappe
Analyse de l'expression différentielle: identification des DEG en grappes
Annotation fonctionnelle et enrichissement des DEG de grappes
● Analyse inter-groupes:
Combinaison de données
Analyse de l'expression différentielle: identification des DEG en groupes
Annotation fonctionnelle et enrichissement des DEG de groupe
● Analyse avancée:
Analyse du cycle cellulaire
Analyse du pseudome
Analyse de la communication cellulaire (CellPhonedB)
Analyse d'enrichissement de l'ensemble de gènes (GSEA)
Analyse de l'échantillon intérieur
Clustering cellulaire:
Analyse de l'expression différentielle: DEG de grappes
Analyse inter-groupe
Analyse de l'expression différentielle: DEG de groupe
Analyse avancée:
Analyse pseudo-temps:
Analyse du cycle cellulaire:
Explorez les progrès facilités par les services de séquençage d'ARN à nulle de BMKGene par 10X Chromium dans ces publications en vedette:
Wang, L. et al. (2021) «L'analyse transcriptomique à cellule unique révèle le paysage immunitaire du poumon dans l'exacerbation de l'asthme résistant aux stéroïdes»,Actes de l'Académie nationale des sciences des États-Unis d'Amérique, 118 (2), p. E2005590118. doi: 10.1073 / pnas.2005590118
Zheng, H. et al. (2022) «Un réseau de régulation globale pour l'expression des gènes dérégulés et la signalisation métabolique anormale dans les cellules immunitaires dans le microenvironnement de la maladie de Graves et de la thyroïdite de Hashimoto»,Frontières en immunologie, 13, p. 879824. Doi: 10.3389 / fimmu.2022.879824 / bibtex.
Tian, H. et al. (2023) «Le transcriptome monocellulaire révèle l'hétérogénéité et les réponses immunitaires des leucocytes après vaccination avec Edwardsiella tarda inactivée dans la plie (Paralichthys olivaceus)»,Aquaculture, 566, p. 739238. Doi: 10.1016 / j.aquaculture.2023.739238.
Yu, Y. et al. (2023) `` La thérapie photodynamique améliore les résultats des inhibiteurs de point de contrôle immunitaire via le remodelage de l'immunité anti-tumurage chez les patients atteints d'un cancer gastrique '',Cancer gastrique, 26 (5), pp. 798–813. doi: 10.1007 / s10120-023-01409-x / métriques.
