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Séquençage d’ARN à noyau unique
Le développement de techniques de capture de cellules uniques et de construction de bibliothèques personnalisées, associé au séquençage à haut débit, a révolutionné les études sur l’expression des gènes au niveau cellulaire. Cette percée permet une analyse plus approfondie et plus complète de populations cellulaires complexes, surmontant les limitations associées à la moyenne de l’expression des gènes sur toutes les cellules et préservant la véritable hétérogénéité au sein de ces populations. Si le séquençage d’ARN unicellulaire (scRNA-seq) présente des avantages indéniables, il rencontre des défis dans certains tissus où la création d’une suspension unicellulaire s’avère difficile et nécessite de nouveaux échantillons. Chez BMKGene, nous abordons cet obstacle en proposant le séquençage d'ARN mononucléaire (snRNA-seq) à l'aide de la technologie de pointe 10X Genomics Chromium. Cette approche élargit le spectre des échantillons se prêtant à l’analyse du transcriptome au niveau unicellulaire.
L'isolement des noyaux est réalisé grâce à la puce innovante 10X Genomics Chromium, dotée d'un système microfluidique à huit canaux avec doubles croisements. Dans ce système, des billes de gel incorporant des codes-barres, des amorces, des enzymes et un noyau unique sont encapsulées dans des gouttes d'huile de la taille d'un nanolitre, formant ainsi une perle de gel en émulsion (GEM). Après la formation du GEM, la lyse cellulaire et la libération de codes-barres se produisent dans chaque GEM. Par la suite, les molécules d’ARNm subissent une transcription inverse en ADNc, incorporant des codes-barres 10X et des identifiants moléculaires uniques (UMI). Ces ADNc sont ensuite soumis à la construction d’une bibliothèque de séquençage standard, facilitant une exploration robuste et complète des profils d’expression génique au niveau unicellulaire.
Plateforme : 10× Plateforme Genomics Chromium et Illumina NovaSeq
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10x Transcriptome spatial de Visium génomique
La transcriptomique spatiale est une technologie de pointe qui permet aux chercheurs d’étudier les modèles d’expression génétique au sein des tissus tout en préservant leur contexte spatial. Une plateforme puissante dans ce domaine est 10x Genomics Visium couplé au séquençage Illumina. Le principe du 10X Visium repose sur une puce spécialisée avec une zone de capture désignée où sont placées les coupes de tissus. Cette zone de capture contient des points à code-barres, chacun correspondant à un emplacement spatial unique dans le tissu. Les molécules d'ARN capturées dans les tissus sont ensuite étiquetées avec des identifiants moléculaires uniques (UMI) au cours du processus de transcription inverse. Ces spots à codes-barres et UMI permettent une cartographie spatiale précise et une quantification de l’expression des gènes à une résolution unicellulaire. La combinaison d’échantillons codés spatialement et d’UMI garantit l’exactitude et la spécificité des données générées. En utilisant cette technologie de transcriptomique spatiale, les chercheurs peuvent acquérir une compréhension plus approfondie de l'organisation spatiale des cellules et des interactions moléculaires complexes se produisant au sein des tissus, offrant ainsi des informations inestimables sur les mécanismes sous-jacents aux processus biologiques dans de multiples domaines, notamment l'oncologie, les neurosciences, la biologie du développement et l'immunologie. , et études botaniques.
Plateforme : 10X Genomics Visium et Illumina NovaSeq
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Séquençage complet de l'ARNm-Nanopore
Bien que le séquençage de l'ARNm basé sur NGS soit un outil polyvalent pour quantifier l'expression des gènes, son recours à des lectures courtes limite son efficacité dans les analyses transcriptomiques complexes. D’autre part, le séquençage des nanopores utilise une technologie à lecture longue, permettant le séquençage de transcrits d’ARNm complets. Cette approche facilite une exploration complète de l’épissage alternatif, des fusions de gènes, de la polyadénylation et de la quantification des isoformes d’ARNm.
Le séquençage des nanopores, une méthode qui s'appuie sur des signaux électriques en temps réel d'une seule molécule nanopore, fournit des résultats en temps réel. Guidé par des protéines motrices, l’ADN double brin se lie aux protéines nanopores intégrées dans un biofilm, se déroulant lorsqu’il traverse le canal nanopore sous une différence de tension. Les signaux électriques distinctifs générés par différentes bases sur le brin d'ADN sont détectés et classés en temps réel, facilitant un séquençage précis et continu des nucléotides. Cette approche innovante surmonte les limitations de lecture courte et fournit une plate-forme dynamique pour une analyse génomique complexe, y compris des études transcriptomiques complexes, avec des résultats immédiats.
Plateforme : Nanopore PromethION 48
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Séquençage complet de l'ARNm -PacBio
Bien que le séquençage de l'ARNm basé sur NGS soit un outil polyvalent pour quantifier l'expression des gènes, son recours à des lectures courtes limite son utilisation dans des analyses transcriptomiques complexes. D’autre part, le séquençage PacBio (Iso-Seq) utilise une technologie à lecture longue, permettant le séquençage de transcrits d’ARNm complets. Cette approche facilite une exploration complète de l’épissage alternatif, des fusions de gènes et de la poly-adénylation. Cependant, il existe d’autres choix pour la quantification de l’expression génique en raison de la grande quantité de données requises. La technologie de séquençage PacBio repose sur le séquençage d’une seule molécule en temps réel (SMRT), offrant un avantage distinct dans la capture de transcrits d’ARNm complets. Cette approche innovante consiste à utiliser des guides d'ondes en mode zéro (ZMW) et des puits microfabriqués qui permettent l'observation en temps réel de l'activité de l'ADN polymérase pendant le séquençage. Au sein de ces ZMW, l'ADN polymérase de PacBio synthétise un brin complémentaire d'ADN, générant de longues lectures qui couvrent l'intégralité des transcrits d'ARNm. Le fonctionnement de PacBio en mode de séquençage circulaire par consensus (CCS) améliore la précision en séquençant de manière répétée la même molécule. Les lectures HiFi générées ont une précision comparable à celle du NGS, contribuant ainsi à une analyse complète et fiable des caractéristiques transcriptomiques complexes.
Plateforme : PacBio Sequel II ; PacBio Revio
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Séquençage de l'ARNm eucaryote-NGS
Le séquençage de l'ARNm, une technologie polyvalente, permet le profilage complet de tous les transcrits d'ARNm dans les cellules dans des conditions spécifiques. Avec ses applications étendues, cet outil de pointe dévoile des profils complexes d’expression génique, des structures génétiques et des mécanismes moléculaires associés à divers processus biologiques. Largement adopté dans la recherche fondamentale, les diagnostics cliniques et le développement de médicaments, le séquençage de l’ARNm offre un aperçu des subtilités de la dynamique cellulaire et de la régulation génétique, suscitant la curiosité quant à son potentiel dans divers domaines.
Plateforme : Illumina NovaSeq X ; DNBSEQ-T7
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Séquençage d'ARNm sans référence-NGS
Le séquençage de l’ARNm permet le profilage complet de tous les transcrits d’ARNm dans les cellules dans des conditions spécifiques. Cette technologie de pointe constitue un outil puissant, dévoilant des profils complexes d’expression génique, des structures génétiques et des mécanismes moléculaires associés à divers processus biologiques. Largement adopté dans la recherche fondamentale, les diagnostics cliniques et le développement de médicaments, le séquençage de l’ARNm offre un aperçu des subtilités de la dynamique cellulaire et de la régulation génétique.
Plateforme : Illumina NovaSeq X ; DNBSEQ-T7
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Séquençage long non codant-Illumina
Les ARN longs non codants (lncRNA) comptent plus de 200 nucléotides qui possèdent un potentiel de codage minimal et sont des éléments essentiels de l'ARN non codant. Présents dans le noyau et le cytoplasme, ces ARN jouent un rôle crucial dans la régulation épigénétique, transcriptionnelle et post-transcriptionnelle, soulignant leur importance dans le façonnement des processus cellulaires et moléculaires. Le séquençage des LncRNA est un outil puissant dans la différenciation cellulaire, l’ontogenèse et les maladies humaines.
Plateforme : Illumina NovaSeq
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Séquençage de petits ARN-Illumina
Les petites molécules d'ARN (ARNs) comprennent les microARN (miARN), les petits ARN interférents (siARN) et les ARN interagissant avec les piwis (piARN). Parmi ceux-ci, les miARN, longs d’environ 18 à 25 nucléotides, sont particulièrement remarquables pour leur rôle régulateur essentiel dans divers processus cellulaires. Avec des modèles d’expression spécifiques aux tissus et aux stades, les miARN présentent une conservation élevée parmi différentes espèces.
Plateforme : Illumina NovaSeq
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Séquençage CircRNA-Illumina
Le séquençage circulaire d'ARN (circRNA-seq) consiste à profiler et analyser les ARN circulaires, une classe de molécules d'ARN qui forment des boucles fermées en raison d'événements d'épissage non canoniques, conférant à cet ARN une stabilité accrue. Alors qu’il a été démontré que certains circARN agissent comme des éponges de microARN, séquestrant les microARN et les empêchant de réguler leurs ARNm cibles, d’autres circARN peuvent interagir avec des protéines, moduler l’expression des gènes ou jouer un rôle dans les processus cellulaires. L'analyse de l'expression des circARN fournit des informations sur les rôles régulateurs de ces molécules et leur importance dans divers processus cellulaires, stades de développement et pathologies, contribuant ainsi à une compréhension plus approfondie de la complexité de la régulation de l'ARN dans le contexte de l'expression des gènes.
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Séquençage du transcriptome entier – Illumina
Le séquençage complet du transcriptome offre une approche complète pour profiler diverses molécules d’ARN, englobant les ARN codants (ARNm) et non codants (ARNlnc, circARN et miARN). Cette technique capture l’intégralité du transcriptome de cellules spécifiques à un moment donné, permettant ainsi une compréhension holistique des processus cellulaires. Également connu sous le nom de « séquençage total de l’ARN », il vise à dévoiler des réseaux de régulation complexes au niveau du transcriptome, permettant des analyses approfondies telles que l’ARN endogène concurrent (ARNce) et l’analyse conjointe de l’ARN. Cela marque la première étape vers la caractérisation fonctionnelle, en particulier pour démêler les réseaux de régulation impliquant les interactions ceARN basées sur les circARN-miARN-ARNm.
