PacBio 2+3 luzera osoko mRNA irtenbidea
Ezaugarriak
● Azterketaren diseinua:
PacBio-rekin sekuentziatutako lagin bat transkripzio-isoformak identifikatzeko
Bereizitako laginak (erreplikatuak eta probatu beharreko baldintzak) sekuentziatutaNGS transkripzioaren adierazpena kuantifikatzeko
● PacBio sekuentziazioa CCS moduan, HiFi irakurketak sortuz
● Luze osoko transkripzioen sekuentziazioa
● Analisiak ez du erreferentziazko genomarik behar; hala ere, enplegatu daiteke
● Analisi bioinformatikoak gene eta isoforma mailan adierazpena ez ezik, lncRNAren, geneen fusioen, poliadenilazioaren eta geneen egituraren azterketa ere barne hartzen du.
Abantailak
● Zehaztasun Handia: HiFi-k %99,9ko zehaztasunarekin irakurtzen du (Q30), NGS-ren parekoa
● Splicing alternatiboaren analisia: transkripzio guztiak sekuentziatzeak isoformaren identifikazioa eta karakterizazioa ahalbidetzen du.
● PacBio eta NGS indarguneen konbinazioa: isoforma mailan adierazpenaren kuantifikazioa ahalbidetzen du, geneen adierazpen osoa aztertzean ezkutatu daitekeen aldaketa agerian utziz
● Espezializazio zabala: PacBio-ren 1100 transcriptoma-proiektu baino gehiago burutu eta 2300 lagin baino gehiago prozesatzen dituen ibilbidearekin, gure taldeak esperientzia ugari eskaintzen dio proiektu guztiei.
● Salmenta osteko laguntza: gure konpromisoa proiektua amaitzea baino haratago hedatzen da 3 hilabeteko salmenta osteko zerbitzu-epearekin. Denbora horretan, proiektuen jarraipena, arazoak konpontzeko laguntza eta galdera-erantzun saioak eskaintzen ditugu emaitzei lotutako edozein zalantza argitzeko.
Lagin-baldintzak eta entrega
| Liburutegia | Sekuentziazio estrategia | Gomendatutako datuak | Kalitate Kontrola |
| PolyA aberastutako mRNA CCS liburutegia | PacBio Sequel II PacBio Revio | 20/40 Gb 5/10 M CCS | Q30≥85% |
| Poly A aberastua | Illumina PE150 | 6-10 Gb | Q30≥85% |
Nukleotidoak
|
| Konk. (ng/μl) | Kantitatea (μg) | Garbitasuna | Osotasuna |
| Illumina liburutegia | ≥ 10 | ≥ 0,2 | OD260/280=1,7-2,5 OD260/230=0,5-2,5 Gelan agertzen da proteina edo DNA kutsadura mugatua edo ez. | Landareetarako: RIN≥4.0; Animalientzat: RIN≥4,5; 5.0≥28S/18S≥1.0; Oinarrizko kota mugatua edo ez |
| PacBio liburutegia | ≥ 100 | ≥ 1,0 | OD260/280=1,7-2,5 OD260/230=0,5-2,5 Gelan agertzen da proteina edo DNA kutsadura mugatua edo ez. | Landareak: RIN≥7,5 Animaliak: RIN≥8,0 5.0≥28S/18S≥1.0; Oinarrizko kota mugatua edo ez |
Laginaren entrega gomendatua
Ontzia: 2 ml zentrifugatzaile-hodia (ez da gomendagarria eztainu-papera)
Laginaren etiketatzea: Taldea+erreplika, adibidez, A1, A2, A3; B1, B2, B3.
Bidalketa:
1. Izotz lehorra:Laginak poltsetan sartu eta izotz lehorrean lurperatu behar dira.
2. RNAstable hodiak: RNA laginak RNA egonkortzeko hodi batean lehortu daitezke (adib. RNAstable®) eta giro-tenperaturan bidal daitezke.
Honako analisia barne hartzen du:
Datu gordinaren kalitatearen kontrola
Poliadenilazio Alternatiboen Analisia (APA)
Fusioaren transkripzioaren azterketa
Splicing alternatiboen analisia
Benchmarking Universal Single-Copy Orthologs (BUSCO) azterketa
Transkripzio-analisi berritzailea: kode-sekuentzien (CDS) iragarpena eta oharpen funtzionala
lncRNA analisia: lncRNA eta helburuen iragarpena
MikroSateliteen identifikazioa (SSR)
Diferentzialki Adierazitako Transkripzioak (DET) analisia
Diferentzialki Adierazitako Geneak (DEG) analisia
DEG eta DETen oharpen funtzionala
BUSCO analisia
Splicing alternatiboen analisia
Poliadenilazio Alternatiboen Analisia (APA)
Diferentzialki Adierazitako Geneak (DEG) eta Transkripzioak (DETs9 azterketa
DET eta DEGen proteina-proteina elkarrekintza sareak
Arakatu BMKGene-ren PacBio 2+3 luzera osoko mRNA-ren sekuentziazioak errazten dituen aurrerapenak argitalpenen bilduma zaindu baten bidez.
Chao, Q. et al. (2019) 'Populus stem transcriptome-ren garapen-dinamika', Plant Biotechnology Journal, 17 (1), 206-219 or. doi: 10.1111/PBI.12958.
Deng, H. et al. (2022) 'Dynamic Changes in Ascorbic Acid Content during Fruit Development and Ripening of Actinidia latifolia (an Ascorbate-Rich Fruit Crop) and the Associated Molecular Mechanisms', International Journal of Molecular Sciences, 23 (10), or. 5808. doi: 10.3390/IJMS23105808/S1.
Hua, X. et al. (2022) 'Paris polyphylla-ko polifilin bioaktiboetan parte hartzen duten bide biosintetikoen iragarpen eraginkorra', Communications Biology 2022 5:1, 5 (1), 1-10 orr. doi: 10.1038/s42003-022-03000-z.
Liu, M. et al. (2023) 'PacBio Iso-Seq eta Illumina RNA-Seq Analysis of the Tuta absoluta (Meyrick) Transcriptome and Cytochrome P450 Genes', Insects, 14 (4), or. 363. doi: 10.3390/INSECTS14040363/S1.
Wang, Lijun et al. (2019) "PacBio molekula bakarreko denbora errealeko analisia erabiliz transkriptomaren konplexutasunari buruzko inkesta Illumina RNA sekuentziazioarekin konbinatuta Ricinus communis-en azido rizinoleikoko biosintesia hobeto ulertzeko", BMC Genomics, 20 (1), 1-17 orr. doi: 10.1186/S12864-019-5832-9/IRUDIAK/7.
