PacBio 2+3 täispikk mRNA lahus
Omadused
● Uuringu ülesehitus:
Ühendatud proov, mis sekveneeriti PacBio abil, et tuvastada transkriptsiooni isovormid
Eraldi proovid (kordused ja testitavad tingimused) järjestatakseNGS transkripti ekspressiooni kvantifitseerimiseks
● PacBio sekveneerimine CCS-režiimis, genereerib HiFi lugemisi
● Täispikkade ärakirjade järjestamine
● Analüüsiks ei ole vaja võrdlusgenoomi; seda võib siiski kasutada
● Bioinformaatiline analüüs ei hõlma mitte ainult ekspressiooni geenide ja isovormide tasemel, vaid ka lncRNA, geenifusioonide, polüadenüülimise ja geenistruktuuri analüüsi
Eelised
● Suur täpsus: HiFi loeb täpsusega >99,9% (Q30), võrreldav NGS-iga
● Alternatiivne splaissimise analüüs: kõigi transkriptide järjestamine võimaldab isovormide tuvastamist ja iseloomustamist.
● PacBio ja NGS tugevuste kombinatsioon: võimaldab ekspressiooni kvantifitseerida isovormi tasemel, paljastades muutused, mis võivad kogu geeniekspressiooni analüüsimisel olla varjatud
● Laialdased teadmised: üle 1100 PacBio täispika transkriptsiooniprojekti lõpuleviimise ja üle 2300 proovi töötlemisega on meie meeskond iga projektiga kaasas palju kogemusi.
● Müügijärgne tugi: meie kohustus ulatub 3-kuulise müügijärgse teenindusperioodiga kaugemale kui projekti lõpetamine. Selle aja jooksul pakume projekti järelmeetmeid, tõrkeotsingu abi ning küsimuste ja vastuste seansse, et vastata tulemustega seotud päringutele.
Näidisnõuded ja kohaletoimetamine
| Raamatukogu | Järjestusstrateegia | Soovitatavad andmed | Kvaliteedikontroll |
| PolyA rikastatud mRNA CCS raamatukogu | PacBio järg II PacBio Revio | 20/40 Gb 5/10 M CCS | Q30≥85% |
| Polü A rikastatud | Illumina PE150 | 6-10 Gb | Q30≥85% |
Nukleotiidid
|
| Kontsentr. (ng/μl) | Kogus (μg) | Puhtus | Terviklikkus |
| Illumina raamatukogu | ≥ 10 | ≥ 0,2 | OD260/280 = 1,7-2,5 OD260/230 = 0,5-2,5 Geelil näidatud valgu- või DNA-saaste on piiratud või puudub üldse. | Taimedele: RIN≥4,0; Loomadele: RIN≥4,5; 5,0≥28S/18S≥1,0; algtaseme tõus on piiratud või puudub |
| PacBio raamatukogu | ≥ 100 | ≥ 1,0 | OD260/280 = 1,7-2,5 OD260/230 = 0,5-2,5 Geelil näidatud valgu- või DNA-saaste on piiratud või puudub üldse. | Taimed: RIN≥7,5 Loomad: RIN≥8,0 5,0≥28S/18S≥1,0; algtaseme tõus on piiratud või puudub |
Soovitatav näidiste kohaletoimetamine
Mahuti: 2 ml tsentrifuugitoru (tinafoolium pole soovitatav)
Näidismärgistus: rühm+kordus nt A1, A2, A3; B1, B2, B3.
Saadetis:
1. Kuivjää:Proovid tuleb pakkida kottidesse ja matta jäässe.
2. RNA-stabiilsed katseklaasid: RNA proove saab kuivatada RNA stabiliseerimistuubis (nt RNAstable®) ja tarnida toatemperatuuril.
Sisaldab järgmist analüüsi:
Toorandmete kvaliteedi kontroll
Alternatiivne polüadenüülimise analüüs (APA)
Fusioontranskripti analüüs
Alternatiivne splaissimise analüüs
Universaalsete ühekoopialiste ortoloogide (BUSCO) analüüs
Uudne transkriptianalüüs: kodeerivate järjestuste (CDS) ennustamine ja funktsionaalne annotatsioon
lncRNA analüüs: lncRNA ja sihtmärkide ennustamine
MicroSatelite Identification (SSR)
Diferentsiaalselt väljendatud transkriptide (DET) analüüs
Diferentsiaalselt ekspresseeritud geenide (DEG) analüüs
DEG-de ja DET-ide funktsionaalne annotatsioon
BUSCO analüüs
Alternatiivne splaissimise analüüs
Alternatiivne polüadenüülimise analüüs (APA)
Diferentsiaalselt ekspresseeritud geenid (DEG) ja transkriptid (DETs9 analüüs).
DET-de ja DEG-de valk-valgu interaktsioonivõrgustikud
Avastage BMKGene'i PacBio 2+3 täispika mRNA sekveneerimise edusamme kureeritud väljaannete kogumiku kaudu.
Chao, Q. et al. (2019) „The developmental dynamics of the Populus stem transkriptome”, Plant Biotechnology Journal, 17(1), lk 206–219. doi: 10.1111/PBI.12958.
Deng, H. et al. (2022) „Askorbiinhappe sisalduse dünaamilised muutused vilja arengu ja Actinidia latifolia (askorbaadirikas puuviljasaak) ja sellega seotud molekulaarmehhanismide küpsemise ajal”, International Journal of Molecular Sciences, 23(10), lk. 5808. doi: 10.3390/IJMS23105808/S1.
Hua, X. et al. (2022) „Paris polyphylla bioaktiivsetes polüfülliinides osalevate biosünteesiraja geenide tõhus ennustamine”, Communications Biology 2022, 5:1, 5(1), lk 1–10. doi: 10.1038/s42003-022-03000-z.
Liu, M. et al. (2023) „Tuta absoluta (Meyricki) transkriptoomi ja tsütokroom P450 geenide kombineeritud PacBio Iso-Seq ja Illumina RNA-Seq analüüs”, Insects, 14(4), lk. 363. doi: 10.3390/INSECTS14040363/S1.
Wang, Lijun jt. (2019) „Uuring transkriptoomide keerukuse kohta, kasutades PacBio ühe molekuli reaalajas analüüsi kombineerituna Illumina RNA sekveneerimisega, et paremini mõista Ricinus communis'e ritsinoolhappe biosünteesi”, BMC Genomics, 20(1), lk 1–17. doi: 10.1186/S12864-019-5832-9/FIGURES/7.
