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Secuenciación de ARN de un solo núcleo

El desarrollo de la captura de células individuales y las técnicas de construcción de bibliotecas personalizadas, junto con la secuenciación de alto rendimiento, ha revolucionado los estudios de expresión génica a nivel celular. Este avance permite un análisis más profundo y más completo de las poblaciones celulares complejas, superando las limitaciones asociadas con el promedio de la expresión génica sobre todas las células y preservar la verdadera heterogeneidad dentro de estas poblaciones. Si bien la secuenciación de ARN de células individuales (SCRNA-seq) tiene ventajas innegables, encuentra desafíos en ciertos tejidos donde la creación de una suspensión de una sola célula resulta difícil y requiere muestras frescas. En BMKGene, abordamos este obstáculo ofreciendo secuenciación de ARN de un solo núcleo (SNRNA-seq) utilizando la tecnología de cromo genómica 10x de vanguardia. Este enfoque amplía el espectro de muestras susceptibles de análisis de transcriptoma a nivel de células individuales.

El aislamiento de los núcleos se logra a través del innovador chip de cromo de genómica 10x, con un sistema de microfluídica de ocho canales con cruces dobles. Dentro de este sistema, las perlas de gel que incorporan códigos de barras, cebadores, enzimas y un solo núcleo se encapsulan en gotas de aceite del tamaño de un nanolitro, formando gel en la emulsión (GEM). Después de la formación de gemas, la lisis celular y la liberación de código de barras se producen dentro de cada gema. Posteriormente, las moléculas de ARNm se someten a una transcripción inversa en ADNA, que incorporan códigos de barras 10x e identificadores moleculares únicos (UMI). Estos ADNc se someten a la construcción de la biblioteca de secuenciación estándar, facilitando una exploración robusta e integral de los perfiles de expresión génica a nivel de células individuales.

Plataforma: 10 × Genomics Chromium e Illumina Novaseq Platform

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Detalles del servicio

Bioinformática

Resultados de demostración

Publicaciones destacadas

Esquema técnico

El aislamiento de los núcleos se logra por 10 × Genomics Chromium ™, que consiste en un sistema de microfluídica de ocho canales con cruces dobles. En este sistema, las cuentas de gel con códigos de barras e imprimación, las enzimas y un solo núcleo están encapsulados en caída de aceite del tamaño de un nanolitro, generando gel en la emulsión (GEM). Una vez que se forman GEM, la lisis celular y la liberación de códigos de barras se realizan en cada gema. El ARNm se transcribe inversamente en moléculas de ADNc con códigos de barras 10 × y UMI, que están sujetos aún más a la construcción de la biblioteca de secuenciación estándar.

Características

● Preparación de suspensión de un solo nucleos de tejidos congelados

● Formación de gel en la emulsión (GEM) seguida de la síntesis de ADNc

● Cada cordón en una gema se carga con cebadores compuestos por 4 secciones:

cola de poli (DT) para cebado de ARNm y síntesis de ADNc,

Identificador molecular único (UMI) para corregir el sesgo de amplificación

10x código de barras

Secuencia de unión de la votación de secuenciación de lectura parcial 1

Ventajas

La secuenciación de ARN de un solo núcleo evita las limitaciones de la secuenciación de ARN de una sola célula, habilitando:

● El uso de muestras congeladas y no solo limitadas a muestras frescas

● Baja estrés de las células congeladas en comparación con el tratamiento enzimático de las células frescas, reflejadas en los datos del transcriptoma en forma de genes menos inducidos por el estrés

● No hay necesidad de eliminación previa de glóbulos rojos

● Diámetro de celda ilimitado

● Gran gama de muestras que son elegibles para el análisis, incluidos los tipos de tejido complejos y frágiles que son propensos al agrupamiento o destrucción celular durante la disociación del tejido

Muestras que no se pueden analizar mediante secuenciación de ARN de una sola célula y son elegibles para la secuenciación de ARN de un solo núcleo:

Célula / tejido	Razón
Tejido congelado sin franco	Incapaz de obtener organizaciones frescas o largas
Célula muscular, megakaryocito, grasa ...	El diámetro de la celda es demasiado grande para ingresar al instrumento
Hígado…	Demasiado frágil para romper, incapaz de distinguir células individuales
Célula neuronal, cerebro ...	Más sensible, fácil de estrés, cambiará los resultados de la secuencia
Pancreas, tiroides ...	Rico en enzimas endógenas, afectando la producción de suspensión de una sola célula

Núcleo vs un solo célula

Soltero	Unicelular
Diámetro de celda ilimitado	Diámetro de la célula: 10-40 μm
El material puede ser tejido de tejido	El material debe ser tejido fresco
Baja estrés de las células congeladas	El tratamiento enzimático puede causar reacción de estrés celular
No es necesario eliminar los glóbulos rojos	Los glóbulos rojos deben eliminarse
Nuclear expresa bioinformación	Toda la célula expresa bioinformación

Presupuesto

Requisitos de muestra

Biblioteca

Estrategia de secuenciación

Datos recomendados

Control de calidad

Tejido animal ≥ 200 mg

Tejido vegetal ≥ 400 mg

10x Biblioteca de ADNc de Genomics SN

Illumina PE150

100k PE lecturas por celda

(100-200 GB)

700-1200 núcleos/μl y la integridad de los núcleos observados bajo microscopio

Para obtener más detalles sobre la orientación de preparación de muestras y el flujo de trabajo de servicio, no dude en hablar con unExperto en bmkgene

Flujo de trabajo de servicio

Anterior: Secuenciación del genoma completo de planta/animal

Próximo: Análisis de asociación de todo el genoma

Incluye el siguiente análisis:

● Control de calidad: número de células, detección de genes, identificación precisa de células, moléculas de ARN y cuantificación de expresión

● Análisis de muestra interna:

Agrupación celular y anotación de clúster

Análisis de expresión diferencial: identificación de DEG en grupos

Anotación funcional y enriquecimiento de los degs de clúster

● Análisis entre grupos:

Combinación de datos

Análisis de expresión diferencial: identificación de DEG en grupos

Anotación funcional y enriquecimiento de los degs grupales

● Análisis avanzado:

Análisis del ciclo celular

Análisis de pseudotima

Análisis de comunicación celular (CellPhonedB)

Análisis de enriquecimiento del conjunto de genes (GSEA)

Análisis de muestra interna

Agrupación celular:

Análisis de expresión diferencial: DEGS de clúster

Análisis entre grupos

Análisis de expresión diferencial: DEGS grupales

Análisis avanzado:

Análisis de pseudotima:

Análisis del ciclo celular:

Explore los avances facilitados por los servicios de secuenciación de ARN de un solo núcleo de BMKGene por 10x cromo en estas publicaciones destacadas:

Wang, L. et al. (2021) 'El análisis transcriptómico de un solo célula revela el paisaje inmune del pulmón en la exacerbación del asma resistente a los esteroides',Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América, 118 (2), p. E2005590118. doi: 10.1073/pnas.2005590118

Zheng, H. et al. (2022) 'Una red reguladora global para la expresión génica desregulada y la señalización metabólica anormal en las células inmunes en el microambiente de la enfermedad de Graves y la tiroiditis de Hashimoto',Fronteras en inmunología, 13, p. 879824. Doi: 10.3389/fimmu.2022.879824/bibtex.

Tian, H. et al. (2023) 'El transcriptoma único de las células descubre la heterogeneidad y las respuestas inmunes de los leucocitos después de la vacunación con Edwardsiella Tarda inactivada en Fleunder (Paralichthys olivaceus)',Acuicultura, 566, p. 739238. Doi: 10.1016/j.aquaculture.2023.739238.

Yu, Y. et al. (2023) 'La terapia fotodinámica mejora el resultado de los inhibidores del punto de control inmune mediante la remodelación de la inmunidad antitumor en pacientes con cáncer gástrico',Cáncer gástrico, 26 (5), pp. 798–813. doi: 10.1007/s10120-023-01409-x/métricas.