Ununura- kernaj rna sekvencado
Teknika Skemo
La izolado de kernoj estas atingita per 10 × Genomics Chromium ™, kiu konsistas ok-kanala mikrofluidika sistemo kun duoblaj krucoj. En ĉi tiu sistemo, ĝelaj bidoj kun barkodoj kaj printempo, enzimoj kaj ununura kerno estas enkapsuligitaj en nanoliter-grandeca oleo-guto, generante ĝelan bidon-en-emulsion (GEM). Post kiam gemo formiĝas, ĉela lizo kaj liberigo de barkodoj estas faritaj en ĉiu gemo. mRNA estas inverse transskribitaj en cDNA -molekulojn kun 10 × barkodoj kaj UMI, kiuj estas plue submetitaj al norma sekvenca biblioteko -konstruado.
Trajtoj
● Preparado de unu-nuklea suspendo el frostigitaj histoj
● Formado de ĝel-en-emulsio (GEM) sekvita de cDNA-sintezo
● Ĉiu bido en gemo estas ŝarĝita per printempoj kunmetitaj de 4 sekcioj:
Poly (DT) vosto por mRNA -printado kaj cDNA -sintezo,
Unika molekula identigilo (UMI) por korekti amplifan fleksiĝon
10x Barcode
Liganta sekvenco de parta legita 1 sekvenca printilo
Avantaĝoj
Unu-nuklea RNA-sekvenco evitas la limojn de unu-ĉela RNA-sekvenco, ebligante:
● La uzo de frostigitaj specimenoj kaj ne nur limigita al freŝaj specimenoj
● Malalta streĉo de frostigitaj ĉeloj kompare kun enzimata traktado de freŝaj ĉeloj, reflektitaj en la transkriptomaj datumoj en formo de malpli streĉ-induktitaj genoj
● Ne necesas antaŭa forigo de ruĝaj globuloj
● Senlima ĉela diametro
● Granda tabelo de specimenoj elekteblaj por analizo, inkluzive de kompleksaj kaj fragilaj histaj tipoj inklinaj al ĉelkradikiĝo aŭ detruo dum disa histo de histo
Specimenoj, kiuj ne povas esti analizitaj per unu-ĉela RNA-sekvenco kaj estas elekteblaj por unuopa kerno RNA-sekvenco:
| Ĉelo / histo | Kialo |
| Malfrukta frosta histo | Nekapabla akiri freŝajn aŭ long-savitajn organizojn |
| Muskola ĉelo, megakariocito, graso ... | Ĉela diametro estas tro granda por eniri la instrumenton |
| Hepato ... | Tro delikata por rompi, nekapabla distingi unuopajn ĉelojn |
| Neŭronĉelo, cerbo ... | Pli sentema, facila por streĉi, ŝanĝos la sekvencajn rezultojn |
| Pankreato, tiroides ... | Riĉa je endogenaj enzimoj, tuŝante la produktadon de ununura ĉela suspendo |
Unu-nukleo vs unuĉelo
| Unu-nukleo | Unuĉelo |
| Senlima ĉela diametro | Ĉela diametro: 10-40 μm |
| La materialo povas esti frosta histo | La materialo devas esti freŝa histo |
| Malalta streĉo de frostigitaj ĉeloj | Enzima traktado povas kaŭzi reagon de ĉela streso |
| Neniuj ruĝaj globuloj bezonas esti forigitaj | Ruĝaj globuloj bezonas esti forigitaj |
| Nuklea esprimas bioinformadon | La tuta ĉelo esprimas bioinformadon |
Specifoj
| Specimaj postuloj | Biblioteko | Sekvenca Strategio | Datumoj Rekomenditaj | Kvalitkontrolo |
| Besta histo ≥ 200 mg Planta histo ≥ 400 mg | 10x Genomics SN cDNA -biblioteko | Illumina PE150 | 100k PE legas per ĉelo (100-200 GB) | 700-1200 kernoj/µl kaj kernaj integrecoj observitaj sub mikroskopo |
Por pliaj detaloj pri specimeno -preparado -gvidado kaj serva fluo de laboro, bonvolu paroli kunSpertulo pri bmkgene
Serva laborfluo
Inkluzivas la jenan analizon:
● Kvalito -kontrolo: Nombro de ĉeloj, detekto de genoj, preciza identigo de ĉeloj, RNA -molekuloj kaj esprimo -kvantigo
● Interna ekzempla analizo:
Ĉelkroĉado kaj grapola notacio
Analizo de Diferenca Esprimo: Identigo de DEGS en amasoj
Funkcia komentario kaj riĉigo de cluster Degs
● Intergrupa analizo:
Kombinaĵo de datumoj
Analizo de diferenca esprimo: Identigo de DEG en grupoj
Funkcia komentario kaj riĉigo de grupo DEGS
● Altnivela analizo:
Analizo de Ĉela Ciklo
Pseudotime -analizo
Analizo de Ĉela Komunikado (Poŝtelefono)
Analizo de Gene Set Riĉiga (GSEA)
Interna-specimena analizo
Ĉelkraĉado:
Analizo de diferenca esprimo: Cluster Degs
Intergrupa analizo
Analizo de diferenca esprimo: Grupo DEGS
Altnivela analizo:
Pseudotime -analizo:
Analizo de Ĉela Ciklo:
Esploru la progresojn faciligitajn de la unu-nukleaj RNA-sekvencaj servoj de BMKGENE per 10x kromo en ĉi tiuj prezentitaj publikaĵoj:
Wang, L. et al. (2021) 'Unu-ĉela transkripta analizo malkaŝas la imunan pejzaĝon de pulmo en steroido-rezistema astmo-pligravigado',Procedoj de la Nacia Akademio de Sciencoj de Usono de Usono, 118 (2), p. E2005590118. doi: 10.1073/pnas.2005590118
Zheng, H. et al. (2022) 'Tutmonda reguliga reto por nereguligita gena esprimo kaj eksternorma metabola signalado en imunaj ĉeloj en la mikroambiente de tomboj' malsano kaj la tiroidito de Hashimoto ',Limoj en imunologio, 13, p. 879824. Doi: 10.3389/fimmu.2022.879824/bibtex.
Tian, H. et al. (2023) 'unu-ĉela transkripto malkovras heterogenecon kaj imunajn respondojn de leŭkocitoj post vakcinado kun neaktivigita Edwardsiella Tarda en Flounder (Paralichthys Olivaceus)',Akvokulturo, 566, p. 739238. Doi: 10.1016/j.aquaculture.2023.739238.
Yu, Y. et al. (2023) 'Fotodinamika terapio plibonigas la rezulton de imunaj kontrolpunktoj per remodelado de kontraŭtumora imuneco en pacientoj kun gastrika kancero',Gastrika kancero, 26 (5), pp 798–813. doi: 10.1007/s10120-023-01409-x/metrikoj.
