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Einzelkern-RNA-Sequenzierung
Die Entwicklung von Einzelzellerfassungs- und benutzerdefinierten Bibliothekskonstruktionstechniken in Verbindung mit Hochdurchsatzsequenzierung hat Genexpressionsstudien auf Zellebene revolutioniert. Dieser Durchbruch ermöglicht eine tiefere und umfassendere Analyse komplexer Zellpopulationen, überwindet die Einschränkungen, die mit der Durchschnittsbildung der Genexpression über alle Zellen verbunden sind, und bewahrt die wahre Heterogenität innerhalb dieser Populationen. Während die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) unbestreitbare Vorteile bietet, stößt sie in bestimmten Geweben auf Herausforderungen, wo sich die Herstellung einer Einzelzellsuspension als schwierig erweist und frische Proben erfordert. Bei BMKGene begegnen wir dieser Hürde, indem wir Einzelkern-RNA-Sequenzierung (snRNA-seq) unter Verwendung der hochmodernen 10X Genomics Chromium-Technologie anbieten. Dieser Ansatz erweitert das Spektrum der Proben, die für die Transkriptomanalyse auf Einzelzellebene geeignet sind.
Die Isolierung der Zellkerne wird durch den innovativen 10X Genomics Chromium-Chip erreicht, der über ein Achtkanal-Mikrofluidiksystem mit doppelten Kreuzungen verfügt. Innerhalb dieses Systems werden Gelkügelchen, die Barcodes, Primer, Enzyme und einen einzelnen Kern enthalten, in Öltropfen in Nanolitergröße eingekapselt, wodurch Gel Bead-in-Emulsion (GEM) entsteht. Nach der GEM-Bildung kommt es in jedem GEM zur Zelllyse und zur Freigabe des Barcodes. Anschließend werden mRNA-Moleküle einer umgekehrten Transkription in cDNAs unterzogen, wobei 10X-Barcodes und Unique Molecular Identifiers (UMIs) integriert werden. Diese cDNAs werden dann dem Aufbau einer Standard-Sequenzierungsbibliothek unterzogen, was eine robuste und umfassende Untersuchung von Genexpressionsprofilen auf Einzelzellebene ermöglicht.
Plattform: 10× Genomics Chromium und Illumina NovaSeq Plattform
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10x Genomics Visium Spatial Transkriptom
Die räumliche Transkriptomik ist eine hochmoderne Technologie, die es Forschern ermöglicht, Genexpressionsmuster innerhalb von Geweben zu untersuchen und gleichzeitig deren räumlichen Kontext zu bewahren. Eine leistungsstarke Plattform in diesem Bereich ist 10x Genomics Visium in Verbindung mit der Illumina-Sequenzierung. Das Prinzip von 10X Visium basiert auf einem speziellen Chip mit einem bestimmten Erfassungsbereich, in dem Gewebeschnitte platziert werden. Dieser Erfassungsbereich enthält Barcode-Punkte, die jeweils einer eindeutigen räumlichen Position im Gewebe entsprechen. Die eingefangenen RNA-Moleküle aus dem Gewebe werden dann während des Reverse-Transkriptionsprozesses mit eindeutigen molekularen Identifikatoren (UMIs) markiert. Diese Barcode-Spots und UMIs ermöglichen eine präzise räumliche Kartierung und Quantifizierung der Genexpression mit einer Einzelzellauflösung. Die Kombination aus räumlich mit Barcodes versehenen Proben und UMIs gewährleistet die Genauigkeit und Spezifität der generierten Daten. Durch den Einsatz dieser Spatial Transcriptomics-Technologie können Forscher ein tieferes Verständnis der räumlichen Organisation von Zellen und der komplexen molekularen Wechselwirkungen innerhalb von Geweben erlangen und unschätzbare Einblicke in die Mechanismen bieten, die biologischen Prozessen in verschiedenen Bereichen zugrunde liegen, darunter Onkologie, Neurowissenschaften, Entwicklungsbiologie und Immunologie und botanische Studien.
Plattform: 10X Genomics Visium und Illumina NovaSeq
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Vollständige mRNA-Sequenzierung – Nanopore
Während die NGS-basierte mRNA-Sequenzierung ein vielseitiges Werkzeug zur Quantifizierung der Genexpression ist, schränkt die Abhängigkeit von kurzen Lesevorgängen ihre Wirksamkeit bei komplexen transkriptomischen Analysen ein. Andererseits nutzt die Nanoporensequenzierung die Long-Read-Technologie und ermöglicht die Sequenzierung von mRNA-Transkripten voller Länge. Dieser Ansatz ermöglicht eine umfassende Untersuchung von alternativem Spleißen, Genfusionen, Polyadenylierung und der Quantifizierung von mRNA-Isoformen.
Die Nanoporensequenzierung, eine Methode, die auf elektrischen Echtzeitsignalen einzelner Nanoporenmoleküle basiert, liefert Ergebnisse in Echtzeit. Geführt durch Motorproteine bindet doppelsträngige DNA an Nanoporenproteine, die in einen Biofilm eingebettet sind, und entwindet sich, wenn sie unter einer Spannungsdifferenz durch den Nanoporenkanal verläuft. Die charakteristischen elektrischen Signale, die von verschiedenen Basen auf dem DNA-Strang erzeugt werden, werden in Echtzeit erkannt und klassifiziert, was eine genaue und kontinuierliche Nukleotidsequenzierung ermöglicht. Dieser innovative Ansatz überwindet Einschränkungen bei kurzen Lesevorgängen und bietet eine dynamische Plattform für komplexe Genomanalysen, einschließlich komplexer transkriptomischer Studien, mit sofortigen Ergebnissen.
Plattform: Nanopore PromethION 48
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mRNA-Sequenzierung in voller Länge – PacBio
Während die NGS-basierte mRNA-Sequenzierung ein vielseitiges Werkzeug zur Quantifizierung der Genexpression ist, schränkt die Abhängigkeit von kurzen Lesevorgängen ihre Verwendung in komplexen transkriptomischen Analysen ein. Andererseits nutzt die PacBio-Sequenzierung (Iso-Seq) die Long-Read-Technologie und ermöglicht die Sequenzierung von mRNA-Transkripten voller Länge. Dieser Ansatz ermöglicht eine umfassende Untersuchung von alternativem Spleißen, Genfusionen und Polyadenylierung. Aufgrund der großen erforderlichen Datenmenge gibt es jedoch auch andere Möglichkeiten zur Quantifizierung der Genexpression. Die PacBio-Sequenzierungstechnologie basiert auf der Einzelmolekül-Echtzeitsequenzierung (SMRT) und bietet einen deutlichen Vorteil bei der Erfassung von mRNA-Transkripten voller Länge. Dieser innovative Ansatz beinhaltet die Verwendung von Nullmodus-Wellenleitern (ZMWs) und mikrogefertigten Wells, die die Echtzeitbeobachtung der DNA-Polymeraseaktivität während der Sequenzierung ermöglichen. Innerhalb dieser ZMWs synthetisiert die DNA-Polymerase von PacBio einen komplementären DNA-Strang und generiert so lange Lesevorgänge, die sich über die gesamten mRNA-Transkripte erstrecken. Der PacBio-Betrieb im CCS-Modus (Circular Consensus Sequencing) erhöht die Genauigkeit durch wiederholte Sequenzierung desselben Moleküls. Die generierten HiFi-Lesevorgänge weisen eine mit NGS vergleichbare Genauigkeit auf und tragen so zu einer umfassenden und zuverlässigen Analyse komplexer transkriptomischer Merkmale bei.
Plattform: PacBio Sequel II; PacBio Revio
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Eukaryotische mRNA-Sequenzierung-NGS
Die mRNA-Sequenzierung, eine vielseitige Technologie, ermöglicht die umfassende Profilierung aller mRNA-Transkripte in Zellen unter bestimmten Bedingungen. Mit seinen vielfältigen Anwendungsmöglichkeiten enthüllt dieses hochmoderne Tool komplexe Genexpressionsprofile, Genstrukturen und molekulare Mechanismen, die mit verschiedenen biologischen Prozessen verbunden sind. Die in der Grundlagenforschung, der klinischen Diagnostik und der Arzneimittelentwicklung weit verbreitete mRNA-Sequenzierung bietet Einblicke in die Feinheiten der Zelldynamik und der genetischen Regulation und weckt die Neugier auf ihr Potenzial in verschiedenen Bereichen.
Plattform: Illumina NovaSeq X; DNBSEQ-T7
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Nicht referenzbasiertes mRNA-Sequenzierung-NGS
Die mRNA-Sequenzierung ermöglicht die umfassende Profilierung aller mRNA-Transkripte in Zellen unter bestimmten Bedingungen. Diese hochmoderne Technologie dient als wirksames Werkzeug und enthüllt komplexe Genexpressionsprofile, Genstrukturen und molekulare Mechanismen, die mit verschiedenen biologischen Prozessen verbunden sind. Die mRNA-Sequenzierung ist in der Grundlagenforschung, der klinischen Diagnostik und der Arzneimittelentwicklung weit verbreitet und bietet Einblicke in die Feinheiten der Zelldynamik und der genetischen Regulation.
Plattform: Illumina NovaSeq X; DNBSEQ-T7
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Lange nichtkodierende Sequenzierung – Illumina
Lange nicht-kodierende RNAs (lncRNAs) sind länger als 200 Nukleotide, besitzen ein minimales Kodierungspotenzial und sind zentrale Elemente innerhalb der nicht-kodierenden RNA. Diese im Zellkern und im Zytoplasma vorkommenden RNAs spielen eine entscheidende Rolle bei der epigenetischen, transkriptionellen und posttranskriptionellen Regulation und unterstreichen ihre Bedeutung für die Gestaltung zellulärer und molekularer Prozesse. Die LncRNA-Sequenzierung ist ein leistungsstarkes Werkzeug für die Zelldifferenzierung, Ontogenese und menschliche Krankheiten.
Plattform: Illumina NovaSeq
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Kleine RNA-Sequenzierung – Illumina
Zu den kleinen RNA-Molekülen (sRNA) gehören microRNAs (miRNAs), kleine interferierende RNAs (siRNAs) und piwi-interagierende RNAs (piRNAs). Unter diesen sind miRNAs mit einer Länge von etwa 18 bis 25 Nukleotiden besonders hervorzuheben, da sie eine entscheidende regulatorische Rolle in verschiedenen zellulären Prozessen spielen. Mit gewebespezifischen und stadienspezifischen Expressionsmustern weisen miRNAs über verschiedene Spezies hinweg eine hohe Konservierung auf.
Plattform: Illumina NovaSeq
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CircRNA-Sequenzierung-Illumina
Die zirkuläre RNA-Sequenzierung (circRNA-seq) dient der Profilierung und Analyse zirkulärer RNAs, einer Klasse von RNA-Molekülen, die aufgrund nichtkanonischer Spleißereignisse geschlossene Schleifen bilden und dieser RNA eine erhöhte Stabilität verleihen. Während gezeigt wurde, dass einige circRNAs als microRNA-Schwämme fungieren, microRNAs binden und sie daran hindern, ihre Ziel-mRNAs zu regulieren, können andere circRNAs mit Proteinen interagieren, die Genexpression modulieren oder eine Rolle in zellulären Prozessen spielen. Die circRNA-Expressionsanalyse liefert Einblicke in die regulatorischen Rollen dieser Moleküle und ihre Bedeutung in verschiedenen zellulären Prozessen, Entwicklungsstadien und Krankheitszuständen und trägt zu einem tieferen Verständnis der Komplexität der RNA-Regulation im Kontext der Genexpression bei.
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Sequenzierung des gesamten Transkriptoms – Illumina
Die Sequenzierung des gesamten Transkriptoms bietet einen umfassenden Ansatz zur Profilierung verschiedener RNA-Moleküle, einschließlich kodierender (mRNA) und nicht-kodierender RNAs (lncRNA, circRNA und miRNA). Diese Technik erfasst das gesamte Transkriptom bestimmter Zellen zu einem bestimmten Zeitpunkt und ermöglicht so ein ganzheitliches Verständnis zellulärer Prozesse. Ziel ist es, auch als „Gesamt-RNA-Sequenzierung“ bezeichnet, komplizierte regulatorische Netzwerke auf Transkriptomebene aufzudecken und so eine tiefgreifende Analyse wie konkurrierende endogene RNA (ceRNA) und gemeinsame RNA-Analyse zu ermöglichen. Dies markiert den ersten Schritt zur funktionellen Charakterisierung, insbesondere zur Aufklärung der regulatorischen Netzwerke, an denen circRNA-miRNA-mRNA-basierte ceRNA-Wechselwirkungen beteiligt sind.
