● Undersøgelsesdesign:
Poolet prøve sekventeret med PacBio for at identificere transkriptisoformer
Separate prøver (replikater og betingelser, der skal testes) sekventeret medNGS til at kvantificere transskriptionsekspression
● PacBio-sekventering i CCS-tilstand, genererer HiFi-læsninger
● Rækkefølge af transskriptionerne i fuld længde
● Analyse kræver ikke et referencegenom; den kan dog anvendes
● Bioinformatisk analyse omfatter ikke kun ekspression på gen- og isoform-niveau, men også analyse af lncRNA, genfusioner, polyadenylering og genstruktur
● Høj nøjagtighed: HiFi læser med nøjagtighed >99,9 % (Q30), sammenlignelig med NGS
● Alternativ splejsningsanalyse: sekventering af alle transskriptioner muliggør isoform identifikation og karakterisering.
● Kombination af PacBio og NGS styrker: muliggør kvantificering af ekspression på isoformniveau, afsløring af ændring, der kan maskeres, når man analyserer hele genekspressionen
● Omfattende ekspertise: Med en track record med at fuldføre over 1100 PacBio transkriptomprojekter i fuld længde og behandle over 2300 prøver, bringer vores team et væld af erfaring med til hvert projekt.
● Support efter salg: Vores engagement strækker sig ud over projektafslutning med en 3-måneders eftersalgsserviceperiode. I løbet af denne tid tilbyder vi projektopfølgning, fejlfindingshjælp og Q&A-sessioner for at løse eventuelle spørgsmål relateret til resultaterne.
Bibliotek | Sekvenseringsstrategi | Data anbefales | Kvalitetskontrol |
PolyA-beriget mRNA CCS-bibliotek | PacBio Sequel II PacBio Revio | 20/40 Gb 5/10 M CCS | Q30≥85 % |
Poly A beriget | Illumina PE150 | 6-10 Gb | Q30≥85 % |
| Konc.(ng/μl) | Mængde (μg) | Renhed | Integritet |
Illumina bibliotek | ≥ 10 | ≥ 0,2 | OD260/280=1,7-2,5 OD260/230=0,5-2,5 Begrænset eller ingen protein- eller DNA-kontamination vist på gel. | For planter: RIN≥4,0; For dyr: RIN≥4,5; 5,0≥28S/18S≥1,0; begrænset eller ingen basislinjestigning |
PacBio bibliotek | ≥ 100 | ≥ 1,0 | OD260/280=1,7-2,5 OD260/230=0,5-2,5 Begrænset eller ingen protein- eller DNA-kontamination vist på gel. | Planter: RIN≥7,5 Dyr: RIN≥8,0 5,0≥28S/18S≥1,0; begrænset eller ingen basislinjestigning |
Anbefalet prøvelevering
Beholder: 2 ml centrifugerør (stanniol anbefales ikke)
Prøvemærkning: Gruppe+replikat f.eks. A1, A2, A3; B1, B2, B3.
Forsendelse:
1. Tøris:Prøver skal pakkes i poser og begraves i tøris.
2. RNA-stabile rør: RNA-prøver kan tørres i RNA-stabiliseringsrør (f.eks. RNAstable®) og sendes i stuetemperatur.
Indeholder følgende analyse:
Kvalitetskontrol af rådata
Alternativ polyadenyleringsanalyse (APA)
Fusion transkript analyse
Alternativ splejsningsanalyse
Benchmarking Universal Single-Copy Orthologs (BUSCO) analyse
Ny transkriptanalyse: forudsigelse af kodende sekvenser (CDS) og funktionel annotering
lncRNA-analyse: forudsigelse af lncRNA og mål
MicroSatelite Identification (SSR)
Analyse af differentielt udtrykte transkripter (DET'er).
Analyse af differentielt udtrykte gener (DEG'er).
Funktionel annotering af DEG'er og DET'er
BUSCO analyse
Alternativ splejsningsanalyse
Alternativ polyadenyleringsanalyse (APA)
Differentielt udtrykte gener (DEG'er) og transkripter (DETs9 analyse
Protein-Protein interaktionsnetværk af DET'er og DEG'er
Udforsk de fremskridt, der er lettet af BMKGene's PacBio 2+3 fuldlængde mRNA-sekventering gennem en kurateret samling af publikationer.
Chao, Q. et al. (2019) 'The developmental dynamics of the Populus stem transcriptome', Plant Biotechnology Journal, 17(1), s. 206–219. doi: 10.1111/PBI.12958.
Deng, H. et al. (2022) 'Dynamiske ændringer i ascorbinsyreindhold under frugtudvikling og modning af Actinidia latifolia (en ascorbatrig frugtafgrøde) og de tilknyttede molekylære mekanismer', International Journal of Molecular Sciences, 23(10), s. 5808. doi: 10.3390/IJMS23105808/S1.
Hua, X. et al. (2022) 'Effektiv forudsigelse af biosyntetiske pathway-gener involveret i bioaktive polyphylliner i Paris polyphylla', Communications Biology 2022 5:1, 5(1), s. 1-10. doi: 10.1038/s42003-022-03000-z.
Liu, M. et al. (2023) 'Kombineret PacBio Iso-Seq og Illumina RNA-Seq analyse af Tuta absoluta (Meyrick) transkriptomet og Cytochrom P450 gener', Insects, 14(4), s. 363. doi: 10.3390/INSECTS14040363/S1.
Wang, Lijun et al. (2019) 'En undersøgelse af transkriptomkompleksitet ved hjælp af PacBio enkeltmolekyle-realtidsanalyse kombineret med Illumina RNA-sekventering for en bedre forståelse af ricinolsyrebiosyntese i Ricinus communis', BMC Genomics, 20(1), s. 1-17. doi: 10.1186/S12864-019-5832-9/FIGURE/7.