Human Genomics
Naturgenetik
Langlæst sekventering identificerer GGC-gentagelsesudvidelser i NOTCH2NLC forbundet med neuronal intranuklear inkluderingssygdom
Ont resequencing | Illumina | Hele Exome -sekventering | CRISPR-CAS9 ONT-målrettet sekventering | RNA-seq | ONT 5MC Methylering Ringing
Højdepunkter
1. Ved sammenkoblingsanalyse på en stor NIID -familie blev der identificeret to sammenkoblede regioner.
2.Ont-baseret langlæst sekventering og CAS-9-medieret berigelse ONT-sekventering opdagede en potentiel genetisk årsag til NIID, GGC-gentagelsesudvidelser i 5 ′ UTR af NOTCH2NLC. Denne undersøgelse rapporterede gentagne udvidelser i humanspecifikke gener for første gang, der udviklede sig gennem segmental duplikationer.
3.RNA -sekventering afslørede unormale antisense -transkripter i begyndelsen eller inde i GGC -gentagelsesområder i NOTCH2NLC.
Baggrund
NEuronal intranuklear inkluderingssygdom (NIID) er en progressiv og dødelig neurodegenerativ sygdom, som er kendetegnet ved tilstedeværelsen af eosinofil hyalin intranukleære indeslutninger i centrale og perifere nervesystemer. Dens meget variable kliniske manifestationer rejser store vanskeligheder med diagnose indtil introduktion af hudbiopsi. Imidlertid lider histopatologibaserede metoder stadig af fejldiagnose, der kræver en genetisk forståelse af NIID.
Præstationer
Koblingsanalyse
SHORT-Read-sekventeringsbaseret helgenomsekventering (WGS) og hele Exome-sekventering (WES) blev udført på en stor NIID-familie (13 påvirkede og 7 upåvirkede medlemmer). Koblingsanalyse på SNP'er ekstraheret fra disse data afslørede kun to sammenkoblede regioner: en 3,5 MB-region ved 1p36.31-p36.22 (maksimal LOD = 2,32) og en 58,1 MB-region ved 1p22.1-Q21.3 (maksimal LOD: 4,21 ). Imidlertid blev der ikke identificeret nogen patogene SNP'er eller CNV'er i disse forbundne regioner.
GGC -gentagelsesudvidelser i NOTCH2NLC
NAnopore-baseret sekventering blev behandlet på 13 påvirkede og 4 upåvirkede medlemmer fra 8 familier (et andet påvirket medlem blev sekventeret af Pacbio Long læst sekventeringsplatform.). Langlæsningsdata afslørede sygdomsassocierede GGC-gentagelsesudvidelser i 5 ′ UTR for NOTCH2NLC-genkortlægning til 58,1 MB-forbundet region (figur 1). Disse gentagne udvidelser blev også identificeret i alle 40 sporadiske NIID-tilfælde testet af RP-PCR.
CAS-9-medieret målsekventering på nanopore platform blev anvendt for at opnå højere læsedækning på NOTCH2NLC-gentagelse (100 x-1,795 x). Disse konsensus -sekvenser var godt med tidligere fund om GGC -gentagelsesudvidelser. Desuden blev {(GGA) N (GGC) N} N-gentagelser identificeret som en potentiel genetisk markør for svaghed-dominerende fænotype (figur 2).
Figur 1. Sygdom, der er forbundet med gentagen ekspansion identificeret på exon 1 af Notch2NLC -isoformer.
Figur 2. Konsensus-sekvenser af NPTCH2NLC-gentagelse hos NIID-patienter med (*) eller uden svaghed-dominerende fænotype
NOTCH2NL-gener er humanspecifikke gener, som antages at spille vigtig rolle i menneskelig hjerneudvikling og neurologiske sygdomme. Imidlertid blev tre Notch2 -relaterede gener (Notch2Nla, Notch2NlB og Notch2NLC) med> 99,1% sekvensidentitet ikke løst før den seneste humane genomforsamling. Syntese-fri og langlæst sekventering på nanopore platform har vist bemærkelsesværdige fordele ved at løse regioner med høj lighed og (GGC) N gentages med 100% GC-rige.
GGC -gentagelsesudvidelser i NOTCH2NLC
TRanscriptome -sekventering blev behandlet på 2 påvirkede og 2 upåvirkede medlemmer. Normaliseret læsedybde blev beregnet på sans og antisense -strenge i opstrøms for første eksoner af NOTCH2NL -paraloger. Der blev kun fundet unormale anti-sense-transkripter i berørte tilfælde, der sidder i begyndelsen eller inde i det gentagne ekspansionsområde (lilla toppe i F1-14 og F1-16 i figur 3.). Derudover blev 54 DEG'er identificeret, og alle blev beriget i GO og MPO -termer relateret til neuronale funktioner.
Figur 3. Normaliseret læsedybde på opstrøms for den første exon af NOTCH2NLC i upåvirket (ovenfor) og påvirkede (nedenfor) tilfælde.
Teknologi
Oxford Nanopore Teghnologies (ONT)
NAnopore -sekventering adskiller sig fra andre sekventeringsplatforme, idet nukleotiderne læses direkte uden DNA -synteseproces. Når en enkelt streng-DNA passerer gennem en nano-størrelse proteinpore (nanopore) genererer forskellige nukleotider forskellige ioniske strømme, som kan fanges og overføres til sekvens af baser. ONT -sekventeringsplatform i sig selv viser ikke tilsyneladende teknisk grænse for længden af DNA -læsning. Derfor er ultra-lange læsninger (ULRS) tilgængelige til genomsamling af høj kvalitet. Desuden hjælper disse ekstremt lange læsninger, som er lange nok til at krydse komplekse sekvensfunktioner eller strukturel variation, at overvinde begrænsningerne i kortlæst sekventering her.
Nanopore -sekventering
Strukturvariation (SV) identifikation
SYnthesis-fri sekventering stort set bevaret DNA-methyleringsinformation om skabelon. Methyleret A, T, C og G genererer forskellige ioniske strømme fra ikke-methylerede, som kan læses direkte af platformen. Nanopore-sekventering giver helgenomprofilering af både 5MC og 6MA ved enkeltnukleotidopløsning.
Reference
Jun Sone, et. Al. Langlæst sekventering identificerer GGC-gentagelsesudvidelser i NOTCH2NLC forbundet med neuronal intranuklear inkluderingssygdom. Nature Genetics (2019)
Teknisk og højdepunkter Mål med at dele den seneste vellykkede anvendelse af forskellige sekventeringsteknologier med høj kapacitet i forskellige reseach-arenaer samt strålende ideer i eksperimentel design og datamining.
Posttid: Jan-06-2022