Jednojaderné sekvenování RNA
Technické schéma
Izolace jader je dosažena pomocí 10× Genomics Chromium™, což je osmikanálový mikrofluidní systém s dvojitým křížením. V tomto systému jsou gelové kuličky s čárovými kódy a primerem, enzymy a jediným jádrem zapouzdřeny v kapce oleje o velikosti nanolitrů, čímž se vytváří gelová kulička v emulzi (GEM). Po vytvoření GEM se v každém GEM provede buněčná lýza a uvolnění čárových kódů. mRNA jsou reverzně transkribovány do molekul cDNA s 10× čárovými kódy a UMI, které dále podléhají standardní konstrukci sekvenační knihovny.
Vlastnosti
● Příprava jednojaderné suspenze ze zmrazených tkání
● Tvorba gelových kuliček v emulzi (GEM) následovaná syntézou cDNA
● Každá kulička v GEM je naplněna primery složenými ze 4 částí:
poly(dT) tail pro priming mRNA a syntézu cDNA,
Unikátní molekulární identifikátor (UMI) pro korekci zkreslení amplifikace
10x čárový kód
Vazebná sekvence sekvenačního primeru částečného čtení 1
Výhody
Jednojaderné sekvenování RNA obchází omezení jednobuněčného sekvenování RNA a umožňuje:
● Použití zmražených vzorků a neomezeno pouze na čerstvé vzorky
● Nízký stres zmražených buněk ve srovnání s enzymatickým ošetřením čerstvých buněk, což se odráží v transkriptomových datech ve formě méně stresem indukovaných genů
● Není třeba předem odstraňovat červené krvinky
● Neomezený průměr buňky
● Velká řada vzorků, které jsou vhodné pro analýzu, včetně komplexních a křehkých typů tkání, které jsou náchylné ke shlukování nebo destrukci buněk během disociace tkáně
Vzorky, které nelze analyzovat jednobuněčným sekvenováním RNA a jsou vhodné pro jednojaderné sekvenování RNA:
| Buňka / tkáň | Důvod |
| Nečerstvě zmrazenou tkáň | Nelze získat nové nebo dlouho uložené organizace |
| Svalové buňky, megakaryocyty, tuk… | Průměr buňky je příliš velký pro vstup do přístroje |
| Játra… | Příliš křehké na rozbití, neschopné rozlišit jednotlivé buňky |
| Neuronová buňka, mozek… | Citlivější, snadno podléhající stresu, změní výsledky sekvenování |
| Slinivka, štítná žláza… | Bohaté na endogenní enzymy ovlivňující produkci suspenze jednotlivých buněk |
Jednojádro vs jednobuněčné
| Jednojádro | Jednočlánkový |
| Neomezený průměr buňky | Průměr buňky: 10-40 μm |
| Materiálem může být zmrazená tkáň | Materiál musí být čerstvý tkáň |
| Nízký stres zmrazených buněk | Enzymová léčba může způsobit buněčnou stresovou reakci |
| Není třeba odstraňovat žádné červené krvinky | Je třeba odstranit červené krvinky |
| Nukleární vyjadřuje bioinformace | Celá buňka exprimuje bioinformace |
Specifikace
| Vzorové požadavky | Knihovna | Strategie sekvenování | Doporučené údaje | Kontrola kvality |
| Živočišná tkáň ≥ 200 mg Rostlinná tkáň ≥ 400 mg | 10x Genomics sn cDNA knihovna | Illumina PE150 | 100K PE čtení na buňku (100–200 Gb) | 700-1200 jader/μl a integrita jader pozorována pod mikroskopem |
Chcete-li získat další podrobnosti o pokynech pro přípravu vzorků a pracovním postupu služeb, neváhejte se obrátit na aExpert BMKGENE
Tok servisní práce
Zahrnuje následující analýzu:
● Kontrola kvality: počet buněk, detekce genů, přesná identifikace buněk, molekul RNA a kvantifikace exprese
● Analýza vnitřního vzorku:
Shlukování buněk a anotace shluků
Diferenciální expresní analýza: identifikace stupňů ve shlucích
Funkční anotace a obohacení klastrových stupňů
● Meziskupinová analýza:
Kombinace dat
Diferenciální expresní analýza: identifikace stupňů ve skupinách
Funkční anotace a obohacení skupinových stupňů
● Pokročilá analýza:
Analýza buněčného cyklu
Pseudočasová analýza
Analýza mobilní komunikace (CellPhoneDB)
Analýza obohacení genové sady (GSEA)
Analýza vnitřního vzorku
Shlukování buněk:
Diferenciální expresní analýza: shlukové stupně
Meziskupinová analýza
Diferenciální expresní analýza: Skupinové stupně
Pokročilá analýza:
Pseudočasová analýza:
Analýza buněčného cyklu:
Prozkoumejte pokroky, které BMKGene usnadňují jednojaderné sekvenační služby RNA od 10X Chromium v těchto doporučených publikacích:
Wang, L. a kol. (2021) „Jednobuněčná transkriptomická analýza odhaluje imunitní krajinu plic při exacerbaci astmatu rezistentního na steroidy“,Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 118(2), str. e2005590118. doi: 10.1073/pnas.2005590118
Zheng, H. a kol. (2022) „Globální regulační síť pro dysregulovanou genovou expresi a abnormální metabolickou signalizaci v imunitních buňkách v mikroprostředí Gravesovy choroby a Hashimotovy tyreoiditidy“,Hranice v imunologii, 13, str. 879824. doi: 10.3389/FIMMU.2022.879824/BIBTEX.
Tian, H. a kol. (2023) „Jednobuněčný transkriptom odhaluje heterogenitu a imunitní reakce leukocytů po očkování inaktivovanou Edwardsiella tarda u platýse (Paralichthys olivaceus)“,Akvakultura, 566, str. 739238. doi: 10.1016/J.AQUACULTURE.2023.739238.
Yu, Y. a kol. (2023) „Fotodynamická terapie zlepšuje výsledek imunitních kontrolních inhibitorů prostřednictvím remodelace protinádorové imunity u pacientů s rakovinou žaludku“,Rakovina žaludku, 26(5), s. 798–813. doi: 10.1007/S10120-023-01409-X/METRICS.
