Usa ka nuclei RNA Sequencing
Teknikal nga Scheme
Ang pagkahimulag sa nuclei nakab-ot sa 10× Genomics Chromium ™, nga naglangkob sa walo ka channel nga microfluidics system nga adunay double crossings. Niini nga sistema, ang usa ka gel beads nga adunay mga barcode ug primer, mga enzyme ug usa ka nucleus giputos sa nanoliter-sized nga oil drop, nga nagpatunghag Gel Bead-in-Emulsion (GEM). Kung maporma ang GEM, ang cell lysis ug pagpagawas sa mga barcode gihimo sa matag GEM. Ang mRNA gibalikbalik nga gi-transcribe ngadto sa mga molekula sa cDNA nga adunay 10 × barcode ug UMI, nga dugang nga gipailalom sa standard sequencing library construction.
Mga bahin
● Pag-andam sa single-nuclei suspension gikan sa frozen tissues
● Pagporma sa Gel Bead-in-Emulsion (GEM) nga gisundan sa cDNA synthesis
● Ang matag bead sa usa ka GEM puno sa mga primer nga gilangkoban sa 4 ka seksyon:
poly(dT) tail para sa mRNA priming ug cDNA synthesis,
Talagsaon nga Molecular Identifier (UMI) aron matul-id ang bias sa amplification
10x nga barcode
Pagbugkos nga han-ay sa partial read 1 sequencing primer
Mga bentaha
Ang single-nucleus RNA sequencing naglikay sa mga limitasyon sa single-cell RNA sequencing, nga makapahimo sa:
● Ang paggamit sa frozen samples ug dili lang limitado sa presko nga sample
● Ubos nga kapit-os sa frozen nga mga selula kon itandi sa enzymatic nga pagtambal sa presko nga mga selula, nga makita sa transcriptome data sa porma sa dili kaayo stress-induced genes
● Dili kinahanglan nga kuhaon una ang pula nga mga selula sa dugo
● Walay kinutuban nga diametro sa cell
● Daghang han-ay sa mga sampol nga angayan sa pagtuki, apil ang komplikado ug huyang nga mga tipo sa tisyu nga daling magkupo-pokus o maguba sa mga selula sa panahon sa pagbulag sa tisyu
Mga sample nga dili ma-analyze pinaagi sa single-cell RNA sequencing ug angayan alang sa single nuclei RNA sequencing:
| Cell / Tissue | Rason |
| Dili bag-o nga frozen nga tisyu | Dili makakuha mga bag-o o dugay nang natipig nga mga organisasyon |
| Muscle cell, Megakaryocyte, Fat… | Ang diametro sa cell dako kaayo aron makasulod sa instrumento |
| Atay… | Huyang kaayo nga mabuak, dili makaila sa usa ka selula |
| Neuron cell, Utok… | Ang labi ka sensitibo, dali nga ma-stress, magbag-o sa mga resulta sa pagsunud |
| Pancreas, thyroid… | Daghan sa endogenous enzymes, nga makaapekto sa produksyon sa usa ka cell suspension |
Single-nucleus vs Single-cell
| Single-nucleus | Usa ka selula |
| Walay kinutuban nga diametro sa cell | Cell diametro: 10-40 μm |
| Ang materyal mahimong frozen nga tisyu | Ang materyal kinahanglan nga presko nga tisyu |
| Ubos nga stress sa mga frozen nga mga selula | Ang pagtambal sa enzyme mahimong hinungdan sa reaksyon sa stress sa cell |
| Dili kinahanglan nga tangtangon ang pula nga mga selyula sa dugo | Ang pula nga mga selula sa dugo kinahanglan nga tangtangon |
| Ang nukleyar nagpahayag sa bioinformation | Ang tibuok selula nagpahayag sa bioinformation |
Mga detalye
| Sample nga Kinahanglanon | Library | Estratehiya sa pagkasunodsunod | Girekomenda ang datos | Pagkontrol sa Kalidad |
| tissue sa mananap ≥ 200 mg Ang tisyu sa tanum ≥ 400 mg | 10x Genomics sn cDNA librarya | Illumina PE150 | 100K PE nga pagbasa kada cell (100-200 Gb) | 700-1200 nuclei/μl ug nuclei integridad naobserbahan ubos sa mikroskopyo |
Alang sa dugang nga mga detalye sa giya sa pag-andam sa sample ug dagan sa serbisyo, palihug ayaw pagduhaduha sa pagpakigsulti sa aEksperto sa BMKGENE
Daloy sa Trabaho sa Serbisyo
Naglakip sa mosunod nga pagtuki:
● Quality Control: gidaghanon sa mga selula, gene detection, tukma nga pag-ila sa mga selula, RNA molekula ug ekspresyon quantification
● Inner Sample Analysis:
Cell clustering ug cluster annotation
Differential Expression Analysis: pag-ila sa mga DEG sa mga cluster
Functional nga anotasyon ug pagpalambo sa cluster DEGs
● Inter-group Analysis:
Kombinasyon sa datos
Differential Expression Analysis: pag-ila sa mga DEG sa mga grupo
Functional annotation ug enrichment sa mga DEG sa grupo
● Abanteng Pagtuki:
Pagtuki sa cell cycle
Pagtuki sa pseudotime
Pagtuki sa komunikasyon sa cell (CellPhoneDB)
Gene Set Enrichment Analysis (GSEA)
Inner-sample nga pagtuki
Cell clustering:
Differential Expression Analysis: cluster DEGs
Pag-analisar sa taliwala sa grupo
Differential Expression Analysis: Group DEGs
Abanteng Pagtuki:
Pagtuki sa Pseudotime:
Pagtuki sa cell cycle:
Susihon ang mga pag-uswag nga gipadali sa BMKGene's single-nucleus RNA sequencing services pinaagi sa 10X Chromium niining mga featured nga publikasyon:
Wang, L. et al. (2021) 'Ang single-cell transcriptomic analysis nagpadayag sa immune landscape sa baga sa steroid-resistant asthma exacerbation',Mga pamaagi sa National Academy of Sciences sa United States of America, 118(2), p. e2005590118. doi: 10.1073/pnas.2005590118
Zheng, H. ug uban pa. (2022) 'Usa ka Global Regulatory Network alang sa Dysregulated Gene Expression ug Abnormal Metabolic Signaling sa Immune Cells sa Microenvironment of Graves' Disease ug Hashimoto's Thyroiditis',Mga utlanan sa Immunology, 13, p. 879824. doi: 10.3389/FIMMU.2022.879824/BIBTEX.
Tian, H. ug uban pa. (2023) 'Ang single-cell transcriptome nagpadayag sa heterogeneity ug immune nga mga tubag sa mga leukocytes human sa pagbakuna sa dili aktibo nga Edwardsiella tarda sa flounder (Paralichthys olivaceus)',Aquaculture, 566, p. 739238. doi: 10.1016/J.AQUACULTURE.2023.739238.
Yu, Y. ug uban pa. (2023) 'Ang photodynamic therapy nagpauswag sa resulta sa immune checkpoint inhibitors pinaagi sa pagbag-o sa anti-tumor immunity sa mga pasyente nga adunay gastric cancer',Kanser sa tiyan, 26(5), pp. 798–813. doi: 10.1007/S10120-023-01409-X/METRICS.
