Seqüenciació d'ARN d'un sol nucli
Esquema Tècnic
L'aïllament dels nuclis s'aconsegueix mitjançant 10× Genomics Chromium™, que consta d'un sistema de microfluídica de vuit canals amb dobles encreuaments. En aquest sistema, s'encapsulen perles de gel amb codis de barres i imprimació, enzims i un únic nucli en una gota d'oli de la mida d'un nanolitre, generant perles de gel en emulsió (GEM). Un cop formats els GEM, es realitza la lisi cel·lular i l'alliberament de codis de barres a cada GEM. L'ARNm es transcriu inversament en molècules d'ADNc amb codis de barres 10 × i UMI, que estan subjectes a més a la construcció estàndard de la biblioteca de seqüenciació.
Característiques
● Preparació de suspensió d'un sol nucli a partir de teixits congelats
● Formació de Gel Bead-in-Emulsion (GEM) seguida de síntesi d'ADNc
● Cada perla d'un GEM està carregada amb imprimadors formats per 4 seccions:
cua poli (dT) per a la preparació de l'ARNm i la síntesi d'ADNc,
Identificador molecular únic (UMI) per corregir el biaix d'amplificació
10x codi de barres
Seqüència d'unió del cebador de seqüenciació de lectura parcial 1
Avantatges
La seqüenciació d'ARN d'un sol nucli evita les limitacions de la seqüenciació d'ARN unicel·lular, permetent:
● L'ús de mostres congelades i no només limitades a mostres fresques
● Baix estrès de cèl·lules congelades en comparació amb el tractament enzimàtic de cèl·lules fresques, reflectit a les dades del transcriptoma en forma de gens menys induïts per l'estrès.
● Sense necessitat d'extirpació prèvia dels glòbuls vermells
● Diàmetre cel·lular il·limitat
● Gran varietat de mostres aptes per a l'anàlisi, inclosos els tipus de teixit complexos i fràgils que són propensos a l'aglomeració o destrucció cel·lular durant la dissociació del teixit.
Les mostres que no es poden analitzar mitjançant la seqüenciació d'ARN unicel·lular i que són elegibles per a la seqüenciació d'ARN d'un sol nucli:
| Cèl·lula / Teixit | Raó |
| Mocador congelat no fresc | No es poden obtenir organitzacions noves o desades des de fa temps |
| Cèl·lula muscular, megacariocit, greix... | El diàmetre de la cel·la és massa gran per entrar a l'instrument |
| fetge… | Massa fràgil per trencar-se, incapaç de distingir cèl·lules individuals |
| Cèl·lula neuronal, cervell... | Més sensible, fàcil d'estressar, canviarà els resultats de la seqüenciació |
| Pàncrees, tiroides... | Ric en enzims endògens, que afecten la producció de suspensió unicel·lular |
Nucli únic vs unicel·lular
| Nucli únic | Unicel·lular |
| Diàmetre cel·lular il·limitat | Diàmetre cel·lular: 10-40 μm |
| El material pot ser teixit congelat | El material ha de ser teixit fresc |
| Baix estrès de les cèl·lules congelades | El tractament enzimàtic pot provocar una reacció d'estrès cel·lular |
| No cal eliminar glòbuls vermells | Cal eliminar els glòbuls vermells |
| Nuclear expressa bioinformació | Tota la cèl·lula expressa bioinformació |
Especificacions
| Exemples de requisits | Biblioteca | Estratègia de seqüenciació | Dades recomanades | Control de qualitat |
| Teixit animal ≥ 200 mg Teixit vegetal ≥ 400 mg | 10x biblioteca d'ADNc de Genomics sn | Il·lumina PE150 | 100K lectures PE per cel·la (100-200 Gb) | 700-1200 nuclis/μl i integritat dels nuclis observada al microscopi |
Per obtenir més detalls sobre la guia de preparació de mostres i el flux de treball del servei, no dubteu a parlar amb aExpert en BMKGENE
Flux de treball del servei
Inclou l'anàlisi següent:
● Control de qualitat: nombre de cèl·lules, detecció de gens, identificació precisa de cèl·lules, molècules d'ARN i quantificació de l'expressió
● Anàlisi de mostra interna:
Agrupació cel·lular i anotació de clúster
Anàlisi d'expressió diferencial: identificació de DEG en clústers
Anotació funcional i enriquiment dels DEG de clúster
● Anàlisi intergrupal:
Combinació de dades
Anàlisi de l'expressió diferencial: identificació de DEG en grups
Anotació funcional i enriquiment dels DEG grupals
● Anàlisi avançada:
Anàlisi del cicle cel·lular
Anàlisi de pseudotemps
Anàlisi de la comunicació cel·lular (CellPhoneDB)
Anàlisi d'enriquiment del conjunt de gens (GSEA)
Anàlisi de la mostra interna
Agrupació cel·lular:
Anàlisi de l'expressió diferencial: Clúster DEG
Anàlisi intergrupal
Anàlisi de l'expressió diferencial: Grup DEG
Anàlisi avançada:
Anàlisi de pseudotemps:
Anàlisi del cicle cel·lular:
Exploreu els avenços facilitats pels serveis de seqüenciació d'ARN d'un sol nucli de BMKGene per 10X Chromium en aquestes publicacions destacades:
Wang, L. et al. (2021) "L'anàlisi transcriptòmica unicel·lular revela el paisatge immune del pulmó en l'exacerbació de l'asma resistent als esteroides",Actes de l'Acadèmia Nacional de Ciències dels Estats Units d'Amèrica, 118(2), pàg. e2005590118. doi: 10.1073/pnas.2005590118
Zheng, H. et al. (2022) "Una xarxa reguladora global per a l'expressió gènica desregulada i la senyalització metabòlica anormal en cèl·lules immunitàries en el microentorn de la malaltia de Graves i la tiroïditis de Hashimoto",Fronteres en immunologia, 13, pàg. 879824. doi: 10.3389/FIMMU.2022.879824/BIBTEX.
Tian, H. et al. (2023) "El transcriptoma unicel·lular descobreix l'heterogeneïtat i les respostes immunitàries dels leucòcits després de la vacunació amb Edwardsiella tarda inactivada a la platassa (Paralichthys olivaceus)",Aqüicultura, 566, pàg. 739238. doi: 10.1016/J.AQUACULTURE.2023.739238.
Yu, Y. et al. (2023) "La teràpia fotodinàmica millora el resultat dels inhibidors del punt de control immunitari mitjançant la remodelació de la immunitat antitumoral en pacients amb càncer gàstric",Càncer gàstric, 26(5), pàgs. 798–813. doi: 10.1007/S10120-023-01409-X/METRICS.
