Jednojezgrene RNK sekvenciranje
Technical Scheme
Izolacija jezgara se postiže pomoću 10× Genomics Chromium™, koji se sastoji od osmokanalnog mikrofluidnog sistema sa dvostrukim ukrštanjima. U ovom sistemu, perle gela sa bar kodovima i prajmerom, enzimi i jedno jezgro su inkapsulirani u kapljicu ulja veličine nanolitara, stvarajući gel perle u emulziji (GEM). Kada se formira GEM, u svakom GEM-u se vrši liza ćelija i oslobađanje bar kodova. mRNA se reverzno transkribuju u cDNK molekule sa 10× bar kodovima i UMI, koji su dalje podložni konstrukciji standardne biblioteke sekvenciranja.
Karakteristike
● Priprema jednonukleusne suspenzije iz zamrznutih tkiva
● Formiranje gel kuglica u emulziji (GEM) praćeno sintezom cDNK
● Svaka kuglica u GEM-u je puna prajmera koji se sastoji od 4 sekcije:
poli(dT) rep za mRNA prajming i cDNK sintezu,
Jedinstveni molekularni identifikator (UMI) za ispravljanje pristranosti pojačanja
10x bar kod
Sekvenca vezivanja prajmera za delimično očitavanje 1 sekvence
Prednosti
Sekvenciranje RNK s jednom jezgrom zaobilazi ograničenja jednoćelijskog sekvenciranja RNK, omogućavajući:
● Upotreba smrznutih uzoraka i ne ograničena samo na svježe uzorke
● Nizak stres zamrznutih ćelija u poređenju sa enzimskim tretmanom svežih ćelija, što se ogleda u podacima transkriptoma u obliku gena izazvanih manje stresom
● Nema potrebe za prethodnim uklanjanjem crvenih krvnih zrnaca
● Neograničen prečnik ćelije
● Veliki niz uzoraka koji su podobni za analizu, uključujući složene i krhke tipove tkiva koji su skloni nakupljanju ili uništavanju ćelija tokom disocijacije tkiva
Uzorci koji se ne mogu analizirati jednoćelijskim sekvenciranjem RNK i koji su podobni za sekvenciranje RNK s jednom jezgrom:
| Ćelija / tkivo | Razlog |
| Nesvježe smrznuto tkivo | Nije moguće dobiti svježe ili dugo sačuvane organizacije |
| Mišićne ćelije, megakariociti, masnoće… | Prečnik ćelije je prevelik za ulazak u instrument |
| Jetra… | Previše krhak da bi se slomio, nesposoban da razlikuje pojedinačne ćelije |
| Neuronska ćelija, mozak… | Osetljiviji, lakši za stres, promeniće rezultate sekvenciranja |
| Gušterača, štitna žlijezda… | Bogat endogenim enzimima koji utiču na proizvodnju jednoćelijske suspenzije |
Jedno jezgro protiv jedne ćelije
| Jedno jezgro | Jednoćelijska |
| Neograničen prečnik ćelije | Prečnik ćelije: 10-40 μm |
| Materijal može biti zamrznuto tkivo | Materijal mora biti svježa maramica |
| Nizak stres zamrznutih ćelija | Tretman enzimima može izazvati reakciju na stres ćelije |
| Ne moraju se uklanjati crvena krvna zrnca | Crvena krvna zrnca se moraju ukloniti |
| Nuklearna ekspresija bioinformacija | Cijela ćelija izražava bioinformaciju |
Specifikacije
| Zahtjevi za uzorke | Biblioteka | Strategija sekvenciranja | Podaci se preporučuju | Kontrola kvaliteta |
| Životinjsko tkivo ≥ 200 mg Biljno tkivo ≥ 400 mg | 10x Genomics sn cDNK biblioteka | Illumina PE150 | 100K PE čitanja po ćeliji (100-200 Gb) | 700-1200 jezgara/μl i integritet jezgara posmatrano pod mikroskopom |
Za više detalja o smjernicama za pripremu uzoraka i toku rada usluge, slobodno razgovarajte sa aBMKGENE ekspert
Tok rada usluge
Uključuje sljedeću analizu:
● Kontrola kvaliteta: broj ćelija, detekcija gena, tačna identifikacija ćelija, RNA molekula i kvantifikacija ekspresije
● Analiza unutrašnjeg uzorka:
Grupiranje ćelija i bilješka klastera
Analiza diferencijalne ekspresije: identifikacija DEG-ova u klasterima
Funkcionalna anotacija i obogaćivanje DEG-ova klastera
● Međugrupna analiza:
Kombinacija podataka
Analiza diferencijalne ekspresije: identifikacija DEG-ova u grupama
Funkcionalna anotacija i obogaćivanje grupnih DEG-ova
● Napredna analiza:
Analiza ćelijskog ciklusa
Pseudovremenska analiza
Analiza ćelijske komunikacije (CellPhoneDB)
Analiza obogaćivanja skupa gena (GSEA)
Analiza unutrašnjeg uzorka
Grupiranje ćelija:
Analiza diferencijalne ekspresije: klaster DEG
Međugrupna analiza
Analiza diferencijalnog izraza: Grupni DEG
Napredna analiza:
Pseudovremenska analiza:
Analiza ćelijskog ciklusa:
Istražite napredak koji omogućava 10X Chromium BMKGene-ove usluge sekvenciranja jednonukleusne RNK u ovim istaknutim publikacijama:
Wang, L. et al. (2021) 'Transkriptomska analiza jedne ćelije otkriva imunološki pejzaž pluća u pogoršanju astme otporne na steroide',Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 118(2), str. e2005590118. doi: 10.1073/pnas.2005590118
Zheng, H. et al. (2022) 'Globalna regulatorna mreža za disreguliranu ekspresiju gena i abnormalnu metaboličku signalizaciju u imunim ćelijama u mikrookruženju Gravesove bolesti i Hashimotoovog tiroiditisa',Granice u imunologiji, 13, str. 879824. doi: 10.3389/FIMMU.2022.879824/BIBTEX.
Tian, H. et al. (2023) 'Transkriptom jedne ćelije otkriva heterogenost i imune odgovore leukocita nakon vakcinacije inaktiviranom Edwardsiella tarda u iverku (Paralichthys olivaceus)',Akvakultura, 566, str. 739238. doi: 10.1016/J.AQUACULTURE.2023.739238.
Yu, Y. et al. (2023) 'Fotodinamička terapija poboljšava ishod inhibitora imunoloških kontrolnih tačaka remodeliranjem antitumorskog imuniteta kod pacijenata sa karcinomom želuca',Rak želuca, 26(5), str. 798–813. doi: 10.1007/S10120-023-01409-X/METRICS.
