РНК секвениране на РНК
Техническа схема
Изолирането на ядра се постига чрез 10 × Genomics Chromium ™, който се състои от осемканална система за микрофлуиди с двойни пресичания. В тази система гел мъниста с баркодове и грунд, ензими и единично ядро се капсулира в капка на маслото с размер на нанолитър, генерирайки гел-мъниста в емулсия (GEM). След като се образуват скъпоценен камък, клетъчният лизис и освобождаването на баркодове се извършват във всеки скъпоценен камък. МРНК се транскрибира обратно в кДНК молекули с 10 × баркодове и UMI, които допълнително подлежат на стандартна конструкция на библиотеката на секвениране.
Характеристики
● Подготовка на суспензия с единични ядки от замразени тъкани
● Формиране на гел-мъниста в емулсия (GEM), последвано от синтеза на cDNA
● Всяко топче в скъпоценен камък е заредено с праймери, съставени от 4 секции:
Поли (DT) опашка за грундиране на мРНК и синтез на кДНК,
Уникален молекулярен идентификатор (UMI) за коригиране на отклоненията на амплификацията
10x баркод
Свързваща последователност на частично четене 1 секвенциозен грунд
Предимства
РНК секвенирането на РНК с едно-ядро заобикаля ограниченията на едноклетъчната РНК секвениране, което позволява:
● Използването на замразени проби и не само ограничено до пресни проби
● Нисък стрес на замразените клетки в сравнение с ензимното лечение на пресни клетки, отразени в данните на транскриптома под формата на по-малко индуцирани от стрес гени
● Няма нужда от предварително отстраняване на червените кръвни клетки
● Неограничен диаметър на клетката
● Голям масив от проби, които отговарят на условията за анализ, включително сложни и крехки типове тъкани, които са предразположени към клетъчно струпване или унищожаване по време на дисоциация на тъканите
Проби, които не могат да бъдат анализирани чрез едноклетъчно РНК секвениране и имат право на секвениране на РНК с единични ядра:
| Клетка / тъкан | Причина |
| Невезна замразена тъкан | Неспособни да получат свежи или отдавна запазени организации |
| Мускулна клетка, мегакариоцит, мазнини ... | Диаметърът на клетката е твърде голям, за да влезе в инструмента |
| Черен дроб ... | Твърде крехко, за да се счупи, не може да се разграничат единичните клетки |
| Невронова клетка, мозък ... | По -чувствителният, лесен за стрес, ще промени резултатите от секвенирането |
| Панкреас, щитовидна жлеза ... | Богати на ендогенни ензими, влияещи върху производството на единична клетъчна суспензия |
Едноклетъчно ядро срещу едноклетъчен
| Едно ядро | Едноклетъчна |
| Неограничен диаметър на клетката | Клетъчен диаметър: 10-40 μm |
| Материалът може да бъде замразена тъкан | Материалът трябва да е прясна тъкан |
| Нисък стрес на замразените клетки | Ензимното лечение може да причини реакция на клетъчен стрес |
| Не е необходимо да се отстраняват червените кръвни клетки | Червените кръвни клетки трябва да бъдат отстранени |
| Ядрената експресира биоинформация | Цялата клетка изразява биоинформация |
Спецификации
| Изисквания за извадка | Библиотека | Стратегия за секвениране | Препоръчва се данни | Контрол на качеството |
| Животинска тъкан ≥ 200 mg Растителна тъкан ≥ 400 mg | 10x геномика sn cDNA библиотека | Illumina PE150 | 100K PE чете на клетка (100-200 GB) | 700-1200 ядра/μL и целостта на ядрата, наблюдавани при микроскоп |
За повече подробности относно насоките за подготовка на проби и работния процес на обслужването, не се колебайте да говорите с aBMKGene Expert
Работен поток на сервиз
Включва следния анализ:
● Контрол на качеството: брой клетки, откриване на гени, точна идентификация на клетките, молекули на РНК и количествено определяне на експресията
● Анализ на вътрешната проба:
Клетъчно клъстериране и анотация на клъстери
Анализ на диференциалния израз: Идентифициране на DEG в клъстери
Функционална анотация и обогатяване на Cluster DEGs
● Междугрупов анализ:
Комбинация от данни
Анализ на диференциален израз: Идентифициране на DEG в групи
Функционална анотация и обогатяване на групови DEGs
● Разширен анализ:
Анализ на клетъчния цикъл
Анализ на псевдотим
Анализ на клетъчната комуникация (CellPhoneDB)
Анализ на обогатяване на гени (GSEA)
Анализ на вътрешната проба
Клетъчно клъстериране:
Анализ на диференциален израз: Cluster DEGs
Междугрупов анализ
Анализ на диференциален израз: групови DEGs
Разширен анализ:
Анализ на псевдотим:
Анализ на клетъчния цикъл:
Разгледайте напредъка, улеснен от услугите за секвениране на РНК на BMKGene от 10x хром в тези представени публикации:
Wang, L. et al. (2021 г.) „Едноклетъчен транскриптомичен анализ разкрива имунният пейзаж на белия дроб при устойчива на стероид астма обостряне“,Протоколи на Националната академия на науките на Съединените американски щати, 118 (2), с. E2005590118. doi: 10.1073/pnas.2005590118
Zheng, H. et al. (2022) „Глобална регулаторна мрежа за дисрегулирана генна експресия и анормална метаболитна сигнализация в имунните клетки в микросредата на болестта на Грейвс и тиреоидита на Хашимото“,Граници в имунологията, 13, с. 879824. Doi: 10.3389/fimmu.2022.879824/bibtex.
Tian, H. et al. (2023 г.) „Едноклетъчната транскриптома разкрива хетерогенност и имунни отговори на левкоцити след ваксинация с инактивирана Edwardesiella tarda в камбана (paralichthys olivaceus)“,Аквакултура, 566, с. 739238. Doi: 10.1016/j.aquaculture.2023.739238.
Yu, Y. et al. (2023) „Фотодинамичната терапия подобрява резултата от инхибиторите на имунната контролна точка чрез ремоделиране на антитумурния имунитет при пациенти със стомашен рак“,Рак на стомаха, 26 (5), стр. 798–813. doi: 10.1007/s10120-023-01409-x/показатели.
